基于NLRP3炎症小体介导细胞焦亡探讨中医药防治自身免疫性甲状腺炎*

陈言,岳新,冯志海,牧亚峰,刘昱君,刘峙岐,史晓雪

1.河南中医药大学第一临床医学院,河南 郑州 450000; 2.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis,AIT)是一类自身免疫性甲状腺疾病,属于甲状腺慢性淋巴细胞炎,一般人群中发病率为1%,90%以上的AIT表现为桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)[1]。血清中甲状腺自身抗体的存在和淋巴细胞浸润是AIT的关键特征。免疫反应是AIT的重要发病机制之一,淋巴细胞浸润可直接对甲状腺组织细胞产生毒性,或者通过细胞因子间接影响细胞功能,从而改变细胞及滤泡结构的完整性并调节其代谢和免疫功能。细胞焦亡是由炎症小体激活的一种细胞死亡过程,其中以NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体的研究最为广泛。近年来,有研究提出炎症小体介导的细胞焦亡是AIT的发病机制之一。本文重点探讨NLRP3介导的细胞焦亡与中医药防治AIT的相关性,为AIT的中医药治疗提供思路。

1 细胞焦亡与NLRP3炎症小体

1.1 细胞焦亡概述细胞焦亡是细胞程序性死亡的途径之一,由炎症小体激活引发,与自身炎症及免疫疾病有关[2]。炎症小体是一种细胞内多聚蛋白复合物,其激活可直接或间接诱发炎症介质的释放及炎症反应。大多数炎症小体由3部分组成:模式识别受体也称炎症小体传感器(pattern recognition receptors,PRRs)、衔接蛋白——细胞凋亡相关斑点样蛋白(associated speck-like protein containing CARD,ASC)和效应蛋白——半胱天冬酶。PRRs根据其结构可分为Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、NLR家族(如NLRP1、NLRP3、NLRC4等)和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)等[3]。NLR家族有20多个成员,大多数由富亮氨酸重复结构域(leucine-rich repeat,LRR)、核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NACHT)和招募域(caspase recruitment domain,CARD)或pyrin结构域(pyrin domain,PYD)组成,其N端包含PYD的称为NLRP,包含CARD的称为NLRC。细胞焦亡过程的激活途径包括依赖caspase-1的典型途径、依赖caspase-4、caspase-5或caspase-11的非典型途径及最近发现的依赖caspase-8、caspase-3的途径[4]。

Gasdermins是一个蛋白质家族,参与细胞焦亡过程的主要是GSDMD和GSDME,其被切割是细胞焦亡的关键环节。Gasdermins包含两个结构域:具有内在孔形成特性的N端结构域和抑制N端孔形成活性的C端结构域[5]。Gasdermins接头切割释放N末端片段,在细胞膜(包括质膜)中寡聚并形成孔。

细胞焦亡的经典信号通路由NLRP3等经典炎症小体激活,需要依赖caspase-1完成,执行蛋白GSDMD是介导该过程的关键[6]。PRRs识别微生物结构后寡聚化,直接与caspase-1结合,或通过募集包含一个PYD和一个CARD的ASC与之结合。NLRP3和AIM2需要依赖ASC才能与caspase-1结合,而NLRP1和NLRC4具有CARD结构域,因此可以独立于ASC直接与caspase-1结合,两种途径均可诱导细胞焦亡[7]。PRR与caspase-1前体(pro-caspase-1)结合后,通过蛋白作用将其水解为caspase-1,caspase-1活化并切割GSDMD,形成N端(N-GSDMD)和能够抑制N端活性的C端(C-GSDMD),N端穿透细胞膜形成非选择性孔,这些孔隙可以增加细胞膜的通透性,利于细胞内外物质交换。由于孔隙的非选择性,细胞膜两侧物质交换不受电解质及渗透压的影响,水的进入导致细胞肿胀,裂解和细胞质内容物释放[8]。此外,caspase-1也有效地将白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的前体加工为成熟的IL-1β和IL-18,炎症因子的释放并不依赖于细胞膜破裂,GSDMD孔足以使其通过细胞膜[9]。

caspase-4、caspase-5、caspase-11介导的激活途径被称为非经典焦亡途径。半胱天冬酶活化后,切割GSDMD并形成N-GSDMD片段,N-GSDMD被寡聚并转移到细胞膜上,插入细胞膜形成孔隙。但caspase-4、caspase-5、caspase-11并不具备将 IL-1β、IL-18前体加工为成熟IL-1β、IL-18 的能力,而是通过诱导细胞内钾的排出促进NLRP3炎症小体的形成,从而激活caspase-1诱导的炎症介质的产生及释放[10]。caspase-3、caspase-8被证明也可诱导细胞焦亡过程。caspase-8可介导一个独立于经典焦亡途径和非经典焦亡途径的替代途径而激活细胞焦亡,称“caspase-8依赖型焦亡”[11]。有研究表明,在caspase-1缺乏或失活的细胞中,caspase-8很容易被募集至“ASC焦点”,与PRR结合并激活,诱导继发性细胞焦亡并直接将炎症因子前体加工至其成熟形式释放至细胞外,且此过程不依赖 GSDMD[12]。caspase-3可特异性切割和激活 GSDME,形成N末端(N-GSDME)与细胞膜结合,诱导细胞焦亡。caspase-3是细胞凋亡诱导因子,存在GSDME的情况下,caspase-3活化通常会导致焦亡特性,因为焦亡的进展快于细胞凋亡[13]。

1.2 NLRP3炎症小体概述NLRP3炎症小体由Nod样模式识别受体NLRP3、ASC和caspase-1构成,属于激活经典焦亡途径的经典炎症小体之一。NLRP3炎症小体的组装需要依靠ASC通过同型作用将活化NLRP3模式识别受体的CARD与pro-caspase-1的CARD结合起来[14]。caspase-1活化后切割GSDMD,形成N-GSDMD穿透细胞膜形成非选择性孔,促进细胞胀裂及IL-1β、IL-18的加工及释放,完成细胞焦亡经典途径。

NLRP3炎症小体可由两种启动信号激活,第一个信号可能是病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),例如革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分——脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),可导致核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路的激活和IL-1β前体的表达。第二个信号可能是损伤相关分子模式(damage-associated molecular molecules,DAMPs),如三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate,ATP),DAMP从受损或应激细胞中释放出来。NLRP3炎症小体可以检测多种微生物信号并通过结合ASC激活caspase-1。caspase-4、caspase-5和caspase-11可直接结合LPS,并通过二聚化诱导的自蛋白水解被激活,进而导致细胞焦亡[15]。

2 AIT与NLRP3炎症小体、细胞焦亡的关系

2.1 AIT的细胞焦亡机制AIT以存在甲状腺特异性自身抗体、淋巴细胞大量浸润、甲状腺细胞坏死及滤泡结构破坏为主要特征,而过度坏死的甲状腺组织细胞可释放相关信号,诱导AIT的免疫反应。甲状腺滤泡上皮细胞(thyroid follicle epithelial cell,TFCs)是AIT免疫反应的靶细胞,在受到PAMP和DAMP刺激时表达Toll样受体,免疫活性细胞相关PRRs被过度激活,以CD4+T细胞为主的自反应性淋巴细胞向甲状腺聚集浸润并分泌,导致自身免疫损伤[16]。同时,Toll样受体可刺激NF-κB通路,从而产生多种促炎细胞因子,如IL-1β、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),这些细胞因子可激活 TFCs 炎症小体的表达,诱导细胞焦亡过程,而坏死的甲状腺组织细胞又可释放ATP等相关损伤信号,促进免疫细胞聚集、浸润,增强自身免疫损伤,诱导AIT的发病[16-17]。先天免疫系统的激活、NF-κB的激活、下游炎症因子的分泌也可刺激B淋巴细胞分化成浆细胞并产生抗体[18]。在没有浸润免疫细胞的情况下,甲状腺细胞也能够响应各种PAMP以启动先天免疫反应。

2.2 AIT与细胞焦亡相关炎症因子IL-1β、IL-18的关系IL-1β、IL-18属于IL-1家族,是有效的促炎细胞因子,由IL-1β、IL-18前体(pro-IL-1β、pro-IL-18)转化而来,可促进诸多自身免疫性疾病的进展。pro-IL-1β、pro-IL-18的合成由PAMP激活的NF-κB通路诱导,并以其生物学非活性形式定位于胞质溶胶中,直到在细胞焦亡过程中被 caspase-1 加工为IL-1β、IL-18后释放,活性IL-1β、IL-18可促进T淋巴细胞分化,介导免疫反应。IL-1β在AIT发育中有重要作用,其对连接蛋白表达的负反馈调节可导致跨上皮阻力的降低、细胞旁流的增加、连接复合物的重排及甲状腺上皮细胞完整性和紧密性的丧失[19]。IL-18使具有强效的干扰素IFN-γ 诱导活性,可增强1型CD4+辅助性T淋巴细胞的活性,在Th1细胞介导的自身免疫性疾病中发挥重要作用[20]。甲状腺炎症细胞浸润可导致Th1细胞因子IFN-γ的产生,并以旁分泌方式发挥免疫作用,增强了甲状腺滤泡上皮细胞中黏附分子和连接蛋白的表达[21]。有研究发现,HT患者甲状腺组织中IL-18的表达增加,从而刺激T淋巴细胞中IFN-γ的产生,并诱导自然杀伤细胞毒性,IFN-γ也可以反过来刺激人类TFCs产生IL-18[22]。

2.3 NLRP3炎症小体介导AIT甲状腺组织细胞焦亡有研究表明,AIT患者甲状腺中PRRs——NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2、炎症小体主要成分ASC和caspase-1 mRNA表达及蛋白质水平,在AIT淋巴细胞浸润区域中TFCs的细胞质内显著升高,甲状腺组织中pro-IL-1β、pro-IL-18的 mRNA 和蛋白表达及活性IL-1β、IL-18水平升高,表明AIT患者甲状腺中的炎症小体激活增强,这可能与AIT患者免疫细胞诱导的肿瘤坏死因子 TNF-α 及INF-γ活性增强有关,且NLRP1 mRNA水平与血清甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab)、抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibodies,Tg-Ab)水平呈正相关,提示炎症小体介导的甲状腺组织细胞焦亡可导致甲状腺组织损伤及AIT的发生[17]。另有研究发现AIT患者甲状腺组织细胞中NLRP3炎症小体的表达显著增强,且Th1、Th17淋巴细胞比例均较正常人上调,提示NLRP3炎症小体在诱导甲状腺组织细胞焦亡的同时可促进T淋巴细胞分化,过度激活免疫反应机制,导致AIT的自身免疫损伤[23]。

过量碘摄入是导致HT的主要因素,有研究提出过量碘摄入可导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加,随后激活TFCs中NF-κB通路和IL-1β的释放,从而激活NLRP3炎性小体,导致GSDMD被切割形成N-GSDMD,进而插入细胞膜中形成孔隙并促进细胞中成熟IL-1β的转化与释放,引起炎症反应,进一步导致甲状腺滤泡上皮细胞的焦亡,研究结果也表明过量碘诱导的HT患者体内N-GSDMD水平升高,因此推断过量碘可通过ROS-NF-κB-NLRP3通路促进HT中甲状腺滤泡上皮细胞的焦亡,从而促进AIT的进展[24]。

3 细胞焦亡与AIT中医病因病机的联系

3.1 AIT中医病因病机AIT属中医“瘿病”范畴,中医认为AIT多与先天因素、情志不调、饮食失节等有关,病位在肝、脾、肾三脏。该病初期多由肝郁脾虚、气郁痰阻所致,情志失调,肝疏泄失常,气机不调,气滞则水液不得运化而成痰,凝结成瘿。日久痰凝则血流不畅而成瘀血,病理产物阻碍气血运行,伤及正气,虚实夹杂,呈脾肾两虚、气阴亏虚、痰凝血瘀之象[25]。病理因素多属“痰、瘀、虚”三类。

3.2 细胞焦亡与AIT中医病机的联系细胞焦亡的中医病机尚无明确定论。在病理研究方面,有研究发现化瘀解毒类中药能够减少细胞炎性坏死,抑制细胞焦亡过程,经滋阴清热类药物干预后炎症因子水平也明显下降,提出“虚”为细胞焦亡之本,“痰、瘀、毒”为细胞焦亡之标[26]。

有学者提出,机体在气阴两虚的状态下,正气不足,易受邪气干扰,机体阴阳失衡,自我调节能力低下,正如机体在病理因素刺激下诱发炎症及免疫反应,导致细胞程序性死亡[26]。细胞焦亡可引起体内炎症因子的生成及相互作用,有研究表明痰浊瘀阻证患者较正常人更容易出现体内炎症反应,炎症因子水平较高,这可能与血流减缓、代谢减慢有关[27]。除此之外,另有观点认为细胞焦亡与“阴阳失衡”密不可分,细胞焦亡过程被认为是阴阳消长过程,可通过理气化痰、清热利湿、化痰除瘀、益气养阴等途径调整体内阴阳,使其恢复平衡状态,这与AIT的中医治法相对应[28]。

4 中药活性成分及复方调控NLRP3炎性小体与细胞焦亡

4.1 中药活性成分调控NLRP3炎性小体与细胞焦亡多种中药有效成分已被证明可通过干预 NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡治疗多系统疾病。三七的提取物三七总皂苷具有调节免疫及抗炎作用,有研究采用三七总皂苷治疗骨关节炎大鼠,结果表明经其干预的大鼠体内TLR4、NLRP3、caspase-1蛋白表达显著下调,且炎症因子IL-1β、IL-18的水平也随之降低,除此之外,软骨细胞焦亡率也显著下降,提示三七总皂苷可能通过调节TLR4/NLRP3/caspase通路抑制软骨细胞焦亡,延缓骨关节炎进展[29]。

白藜芦醇是一种提取自多种植物的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化的药理作用。有学者将其应用于动脉粥样硬化大鼠,结果显示NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表达水平有效降低,血管平滑肌细胞的焦亡率及钙化指标也随之下降,该研究表明白藜芦醇可有效减少动脉粥样硬化的血管钙化,其机制可能与抑制NLRP3炎症小体介导的血管平滑肌细胞焦亡有关[30]。

灯盏花乙素提取自灯盏细辛,具有抗炎、抗氧化等药理作用,有研究证明经LPS、ATP处理的内皮细胞活力明显降低,NLRP3、ASC、pro-caspase-1的蛋白表达水平及炎症因子IL-1β、IL-18的含量显著提高,且效应蛋白GSDMD含量也随之升高,而灯盏花乙素可逆转这些改变,提示灯盏花乙素可抑制诱导的内皮细胞损伤和细胞焦亡[31]。

人参皂苷是中药人参的主要活性成分,具有调节免疫、抗肿瘤等作用,有研究发现人参皂苷Rg1可有效减少心肌纤维化模型小鼠心肌成纤维细胞的活化及心肌组织纤维沉积,并显著降低细胞焦亡相关指标NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达水平及下游靶炎症因子IL-1β的含量,提示人参皂苷可能通过NLRP3/caspase-1通路抑制心肌组织细胞焦亡,从而延缓心肌纤维化的进展[32]。

中药活性成分除以上通过抑制细胞焦亡发挥治疗疾病的作用外,还可通过增强细胞焦亡作用保护机体。茯苓多糖是中药茯苓的主要活性成分,经其干预的肝癌细胞内NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β 蛋白表达水平显著上调,减弱了肝癌细胞的迁移能力,加速了肝癌细胞的死亡[33]。

4.2 中药复方调控NLRP3炎性小体与细胞焦亡中药复方成分复杂,可通过干预多通路、多靶点发挥治疗作用,NLRP3炎症小体/细胞焦亡是其中重要的通路之一。独活寄生汤以治疗中医“痹证”著称,类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)属中医“痹证”范畴,因此独活寄生汤被广泛应用于RA治疗中。有研究将独活寄生汤应用于RA模型大鼠,探讨其缓解RA的细胞焦亡机制,结果表明经独活寄生汤干预的RA大鼠软骨细胞中NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表达水平显著下调,软骨细胞活化程度有效降低,提示独活寄生汤可能通过调控NLRP3/caspase通路介导的软骨细胞焦亡改善RA[34]。

中医认为炎症由“毒邪”所致,清热解毒法可有效改善炎症状态,例如,四妙勇安汤可用于改善动脉粥样硬化(atheoscleorsis,AS)的血管炎症,有研究表明AS模型小鼠主动脉细胞TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均升高,且炎症因子IL-1β、IL-18含量随之上调,而四妙勇安汤可显著抑制这些细胞因子的产生,提示四妙勇安汤可有效减少主动脉斑块的形成及AS的进展,其干预机制可能与调控TLR4/NLRP3/caspase-1通路抑制主动脉细胞焦亡有关[35]。

有实验证明当归补血汤对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)模型大鼠可发挥肾脏保护作用,经其干预的DN大鼠尿蛋白显著减少,肾脏组织硫氧还蛋白相互作用蛋白、caspase-1、GSDMD蛋白表达显著增强,且足细胞内NLRP3炎症小体的表达受到有效抑制,提示当归补血汤可调控TXNIP/NLRP3/GSDMD通路抑制足细胞焦亡,从而发挥对DN大鼠的肾脏保护作用[36]。

5 中药干预NLRP3炎性小体介导细胞焦亡改善AIT

5.1 中药活性成分干预NLRP3炎性小体介导细胞焦亡改善AIT桑色素一般指桑黄素,是一种黄酮类化合物,来源广泛,可从桑科植物和其他多种中药中提取。现代药理学研究证明其具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调血脂、降血压等作用。有学者探讨了桑色素能否通过调节NLRP3/caspase-1通路改善大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis,EAT),结果表明桑色素可下调NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平,且 TPO-Ab、Tg-Ab含量也明显下降,研究提示桑色素可能通过抑制NLRP3/caspase-1通路改善AIT的炎症反应[37]。

柴胡皂苷A来源于伞形科植物北柴胡,药理研究表明其具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、调节免疫等作用。有研究发现EAT大鼠血清TPO-Ab、Tg-Ab、T3显著升高,且免疫荧光染色及Western Blot结果显示NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达显著上升,炎症因子IL-1β水平显著上调,而经柴胡皂苷A干预后均显著下降,表明柴胡皂苷A可抑制NLRP3炎症小体的激活[38]。该实验提示柴胡皂苷A可能通过干预NLRP3炎症小体的激活改善AIT。

大黄素提取自中药虎杖的干燥根茎和根,具有抗肿瘤、抑制免疫、抗炎等多种药理作用。经大黄素干预的EAT大鼠血清甲状腺自身抗体含量及IFN-γ、IL-4等炎症因子表达下降,调节免疫失衡状态,且下调了NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平,研究结果提示大黄素可通过抑制NLRP3/caspase-1通路改善EAT免疫反应[39]。

5.2 中药复方干预NLRP3炎性小体介导细胞焦亡改善AIT阳和汤在古籍中主治阴疽漫肿无头,皮色不变,酸痛无热,现代药理学研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫、强心利尿、扩血管、抗血小板聚集等作用,临床常用于治疗乳腺炎、乳腺癌、消化性溃疡、心力衰竭、糖尿病足及免疫性疾病如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病。近年来有研究发现,经阳和汤干预的EAT大鼠体内甲状腺自身抗体TPO-Ab、Tg-Ab、促甲状腺激素、甲状腺激素(T3、T4)水平显著降低,同时,阳和汤也抑制了NLRP3炎症小体的活性,显著下调了NF-κB信号通路水平、ASC、caspase-1蛋白表达及IL-1β、IL-18的含量,结果提示阳和汤可能通过抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡过程改善自身免疫性甲状腺炎[40]。

6 讨论

AIT的治疗一直是国内外内分泌领域研究的重点,免疫失衡和炎症反应一直是AIT研究的热点,但细胞焦亡为AIT发病机制的研究提供了新思路,抑制炎症小体介导的细胞焦亡过程可成为治疗AIT的新靶点。NLRP3炎症小体作为介导细胞焦亡关键的经典炎症小体,无论是在经典焦亡途径,还是在非经典焦亡途径中均发挥重要作用,从而诱导AIT的细胞焦亡过程。中医药在治疗AIT方面有其独特的优势和特色,其作用机制众多。近年来,多种中药有效成分及中药复方被证明可通过抑制NLRP3炎症小体的激活从而改善AIT,但这些研究往往仅基于免疫平衡机制探讨中药对AIT的治疗作用,目前中药单体及复方干预NLRP3炎症小体介导的甲状腺细胞焦亡过程的研究较少,因此,基于细胞焦亡机制探讨中医药干预AIT的研究十分必要,可进一步明确中药治疗AIT的作用靶点,为AIT的中医药治疗提供用药思路。除此之外,中药复方成分较多,往往通过多通路、多机制发挥治疗作用,通路间是否互相影响尚需进一步探讨,以明确其具体作用机制。综上所述,基于NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡在AIT治疗中的深入研究,可为中药改善AIT炎症免疫微环境提供新策略。