植物提取物对动物腹泻致病菌的抑菌作用及机制研究进展

李瑜瑶 高品一 李丹琦,3 刘学贵

(1.沈阳化工大学功能分子研究所,沈阳 110142;2.沈阳化工大学制药与生物工程学院,沈阳 110142;3.辽宁省绿色功能分子设计与开发重点实验室,沈阳 110142;4.沈阳化工大学硼镁资源开发与精细化工技术国家地方联合工程实验室,沈阳 110142)

细菌性腹泻是由肠道内菌群失调引起的。目前,主要的腹泻致病菌有革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和单核细菌增生李斯特菌等;革兰氏阴性菌,如大肠埃希菌、沙门氏菌、志贺氏菌和巴氏杆菌等[1]。在畜禽生产过程中,以往抗生素被用作饲料添加剂来提高畜禽养殖的生产效益。然而,抗生素的过度使用引发了细菌耐药性的产生,导致畜禽肉类抗生素残留含量超标,引发食源性疾病等一系列问题。因此,传统抗生素作为饲料添加剂已经被严令禁止,饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中草药除外)的商品饲料。植物提取物富含多种抗菌活性成分,包括黄酮、萜类、酚类等物质,这些生物活性成分对引起动物腹泻的主要致病菌具有较好的抗菌功能[2-4]。植物提取物作为饲料添加剂已经成为替抗、减抗的热门研究课题。本文综述了植物提取物对家禽腹泻致病菌的研究进展,旨在为植物提取物作为饲料添加剂在畜禽业的开发及应用中提供参考。

1 植物提取物的抑菌成分药用部位和抑菌活性成分

1.1 植物提取物的抑菌成分药用部位

植物不同部位提取物可能都具有一定的抑菌效果,如植物的根、茎、叶、花、果实等部位均有抑制腹泻致病菌的化学成分[5-9]。据报道,亚麻种子提取物粪肠球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌等5种肠道致病菌具有较好的抑菌效果[10]。研究发现,藜麦壳中提取的6种不同化合物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌均有抗菌作用[11]。毛叶木姜子的花、叶提取出的精油对大肠杆菌和沙门氏菌有抑菌作用[12]。Atiarrahman等[13]采用甲醇等3种有机溶剂提取青野槁树皮,其中甲醇粗提物的抑菌效果最好。

1.2 植物提取物的抑菌活性成分

植物提取物的抑菌活性成分种类多、含量差异大,不同抑菌活性成分抑菌效果不同。研究发现,黄酮、酚类、生物碱、有机酸、皂苷、挥发油、多糖这些主要抑菌活性成分对腹泻致病菌具有良好的抗菌功能。Yao等[14]报道了杨梅果实乙酸乙酯提取物对沙门氏菌、李斯特菌、志贺氏菌具有显著抑菌活性,其中黄酮类化合物种类居多。酚类化合物是许多抑菌效果优异的植物提取物的主要抑菌活性成分,如Indrianingsih等[15]报道了可可豆荚壳提取物中二氯甲烷可溶性组分对大肠杆菌的抑菌活性最高,己烷可溶性组分对金黄色葡萄球菌抑菌活性极强,通过傅里叶红外光谱(FTIR)分析发现这2类组分中均含有较多酚类分子。Nguiam等[16]报道了胡椒树树皮乙醇提取物对福氏志贺氏菌具有显著抑菌活性,经液相色谱串联质谱分析,鉴定出10种化合物,成分包含90%的二萜类和10%的倍半萜类。另有研究表明,饲喂仔猪添加了苜蓿多糖的饲粮,其生长性能和肠道健康状况高于未添加苜蓿多糖的对照组[17]。挥发油也是抑菌主要生物活性物质,如蜡菊提取物蜡菊油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较高的抑制作用,蜡菊油化学成分中乙酸橙花酯占32.65%[18]。

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge.)为蔷薇科山楂属落叶乔木植物,其被收录进饲料原料目录。有文献报道,山楂叶抑菌主要的生物活性成分为黄酮和酚类,如Belabdelli等[19]报道了山楂叶乙醇提取物抑菌效果显著,通过高效液相色谱法从山楂叶提取物中分离鉴定出9种黄酮和酚类化合物,其中芦丁、牡荆素-2-O-鼠李糖苷、山奈酚和绿原酸含量较高。Zhang等[20]研究发现,山楂果实甲醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用较好,经成分分析表明,提取物中总黄酮和总多酚含量较高,主要的酚类化合物为儿茶素、原花青素B2、绿原酸。Benabderrahmane等[21]采用乙酸乙酯和正丁醇提取山楂叶和果实,提取物对革兰氏阳性菌有显著的抑菌活性,分析表明,芦丁、槲皮素、咖啡酸等化学成分为主要抑菌活性成分。相关研究发现,以山楂叶水提取物为还原剂和封盖剂制备银-四氧化三铁(Ag-Fe3O4)纳米材料,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较好,通过光谱分析发现提取物中的多酚起到重要作用[22]。

2 植物提取物对腹泻致病菌的抑菌活性研究

植物提取物作为替抗饲料添加剂的主要评价指标是抑菌活性。目前,抑菌活性强弱的比较方法有观察抑菌圈大小、比较最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)大小。一般采用琼脂扩散法确定植物提取物的抑菌活性,具体方法有牛津杯法、药敏片法、打孔法;而采用微量肉汤稀释法测定其MIC,包括硝基四紫唑(INT)显色法、噻唑蓝(MTT)比色法、刃天青微孔显色法、比浊法等多种方法。根据植物提取物的状态、溶解度、颜色等选择相应最合适的试验方法。

2.1 单一植物提取物的抑菌活性

许多植物提取物有较好的抑菌作用。Mrabti等[23]研究发现,杨梅根的甲醇、乙酸乙酯及二氯甲烷提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC在12.5～50.0 mg/mL,抑菌作用比较明显,其中杨梅根的甲醇提取物对金黄色葡萄球菌抑菌活性最好,MIC为12.5 mg/mL,而杨梅根的水提取物对几种供试菌的抑菌效果较弱。Hemeg等[24]报道了鼠尾草叶、番石榴叶、油橄榄叶等乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌等6种供试菌的MIC在625～5 000 μg/mL。Yogeswara等[25]报道了大风叶50%甲醇-水溶液对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和蜡样芽孢杆菌的MIC在8～128 μg/mL,抑菌效果较好。匡秀华等[26]研究表明,互叶白千层枝叶提取物茶树精油对沙门氏菌的MIC为10.54 mg/mL,具有较好的抑菌作用。Farhana等[27]研究表明,穿心莲根甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取物对伤寒沙门氏菌、志贺氏菌和粪肠球菌的抑菌圈为38～45 mm,其中,甲醇提取物对伤寒沙门氏菌的抑菌效果最好,抑菌圈为45 mm,3种不同溶剂穿心莲根提取物对供试菌的MIC为2.5～4.5 μg/mL,抑菌活性较高。

山楂是我国传统药材,含有丰富的微量元素和营养物质。有研究发现,山楂提取物中的活性物质对革兰氏阳性菌具有较强的抑菌作用,Belabdelli等[19]报道了山楂叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌MIC为0.512 mg/mL,具有强的抑菌活性,而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌基本没有抑菌活性。Zhang等[20]研究发现,甲醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好,MIC为1.25 μg/mL。Kilic等[28]报道了山楂叶4种不同极性溶剂的提取物对大肠杆菌等7种供试菌的MIC在125～500 μg/mL,抑菌活性都比较好。Benabderrahmane等[21]对三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇3种溶剂的山楂果实和叶提取物的抑菌作用做了评价,发现其对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果,对大肠杆菌的抑菌效果不明显。以山楂叶水提取物为还原剂和封盖剂制备的Ag-Fe3O4纳米材料抑菌效果显著,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率在40%～46%[22]。植物提取物的抑菌活性如表1所示。

表1 植物提取物的抑菌活性

2.2 复合植物提取物的抑菌活性

目前,许多研究将2种或2种以上的植物提取物按照不同比例进行复配,形成复合植物提取物,通过相关试验考察其抑菌效果。戴悦等[29]研究发现,花椒与石榴皮复合植物提取物对沙门氏菌的MIC为3.125 mg/mL,抑菌效果高于单一植物提取物。Liang等[30]研究发现,蒲公英提取物、黄芪总黄酮、黄芪多糖以及益生菌的5∶2∶2∶2复配物对大肠杆菌的抑制存在协同作用,单一组分作用呈中度敏感,上述比例联合抑菌效果呈高度敏感。Tiwana等[31]以诃子、余甘子、油榄仁3种植物果实甲醇提取物作为主要原料,以水和乙酸乙酯提取物作为辅助原料,探究复配物的抑菌作用,结果发现,部分植物提取物1∶1组合时,可协同抑制大肠杆菌生长。综上所述,几种植物提取物复合使用具有较好的抑菌活性,但探究复合植物提取物抑菌作用机制仍需大量研究工作。

3 植物提取物对腹泻致病菌的抑菌机制

植物提取物的抑菌机制主要通过对比细菌形态、细菌菌体数量、细菌酶活性、细胞生物膜、蛋白质、遗传物质、电导率变化、毒力因子、炎症因子、活体动物体征变化等收集植物提取物抑菌效果的信息。目前,抑菌机制的主要研究方法包括转录组学[32]、代谢组学[33]、分子对接结合试验验证[34]等。

3.1 植物提取物主要抑菌作用机制

3.1.1 通过影响菌体正常代谢实现抑菌效果

一般情况下,ATP对细胞物质运输、信息交换和能量传递等具有重要作用。Wang等[35]研究发现,金黄色葡萄球菌的ATP活性随槲皮素浓度的增加而增加,植物提取物中的槲皮素通过影响能量代谢进而抑制细菌生长。琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和呼吸链脱氢酶等呼吸代谢关键酶发生变化时,可以影响细菌的正常代谢水平。He等[33]报道了香菜精油中的芳樟醇作用单核增生乳杆菌4 h后,琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶活性与对照组相比降低了30%～50%,细菌呼吸代谢活性减弱,表明芳樟醇可以抑制单核增生乳杆菌的呼吸代谢,碳水化合物正常代谢可能被破坏,能量供应无法正常进行,阻碍细胞生长。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是细胞次级代谢产物,一般情况下异常水平的ROS可以引起脂质氧化、蛋白质氧化、DNA链断裂等,造成细胞损伤。Luo等[36]研究发现,丁香提取物中的丁香酚作用霉菌后,致使ROS过量产生,推测抑菌机制是霉菌经丁香酚作用后ROS的异常水平导致脂质过氧化,影响菌体正常代谢。另有研究表明,辣椒提取物中肉桂酸可能通过与葡萄糖和ATP作用产生苯丙素类化合物辣椒素和二氢辣椒素2种次生代谢物,ATP活性的减少导致金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌菌体能量代谢异常,辣椒素和二氢辣椒素抑制细菌生长[37]。还有研究发现,蜡菊提取物蜡菊油处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后,二者菌体内部的ATP活性分别降低了7.35%和13.31%,表明蜡菊油消耗细菌ATP,扰乱细菌内的能量代谢[18],进而达到抑菌的效果。

3.1.2 通过改变菌体细胞膜的通透性实现抑菌效果

完整的细胞膜可以防止物质自由进出细胞,保证胞内外环境稳定和细菌正常生长,因为细胞膜受损会导致胞内物质流出,致使细菌死亡。Dong等[11]研究发现,藜麦提取物中皂苷作用于蜡样芽孢杆菌,6～22 h内核酸释放量逐渐增加,表明细胞膜破裂,细菌细胞内核酸、蛋白质流失,藜麦皂苷可以破坏菌体细胞膜达到抑菌效果。Mombeshora等[38]报道,添加不同浓度的乙醇、丙酮提取的中华特尔马叶提取物可破坏铜绿假单胞菌细胞膜完整性,改变细胞膜通透性,造成菌体核酸泄露,提取物浓度不同,泄露量不同,抑菌效果不同。Liu等[39]研究发现,添加0.5、1.0倍MIC的山楂多酚后,大肠杆菌的生长受到限制;扫描电镜下大肠杆菌细胞膜损伤,随作用时间增加,细菌逐渐解体,表明山楂多酚的抑菌作用机制可能是多酚与菌体细胞膜相互作用,膜结构受损,进而导致菌体死亡。

Dougnon等[40]研究表明,1～2倍MIC的山茱萸水提物对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的外膜失稳率高于阳性对照药头孢克肟,抗菌机理可能是植物提取物主要抗菌物质酚类化合物络合较多的二价离子,外膜失稳率大,外膜稳定性降低,导致细菌细胞质膜的破裂,质膜通透性增加,酚类化合物破坏细菌膜中蛋白质,改变胞内外的离子稳定状态,从而达到抑菌效果。Karnjana等[41]报道,香茅、鹊肾树、丁香蒲桃3种乙醇提取物降低了变形链球菌菌体表面疏水性和减少细菌生物膜的合成,抑制菌体分离,减少细菌正常生长数量,且提取物中分离得到的木犀草素与细菌菌体的葡萄糖基转移酶蛋白相互作用,抑制生物膜活性,导致细胞膜面积减少,进而达到抑菌效果。Abass等[42]通过结晶紫法发现,黄连木醇提取物处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌3和6 h后,检测到细菌细胞内核酸泄露,表明黄连木醇提取物可破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜的合成,达到抑菌效果。

3.1.3 通过破坏菌体细胞壁实现抑菌效果

细胞壁是细胞的最外层,细胞壁的完整性是保证细菌细胞结构完整的前提;碱性磷酸酶(AKP)位于细菌的细胞膜和细胞壁之间。正常情况下,在细胞外检测不到AKP,当细菌细胞壁受损时,AKP流出则会被检测到。Kamonwannasi等[43]研究发现,沉香叶水提物在MIC下处理金黄色葡萄球菌24 h后,金黄色葡萄球菌出现肿胀扭曲,细胞外检测到AKP,细菌细胞壁被破坏,位于细胞壁上的特异性黏附物与沉积在菌体表面的基质组分无法正常作用,阻碍细菌生物膜正常合成,致使细菌胞内物质流出。细胞壁主要由壁酸(teichoic acids,TAs)和肽聚糖组成。有研究发现,苦参黄酮作用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌后,菌体内自溶酶(autolysis enzyme,Atl)的表达增加,壁酸转运被阻断,导致细胞壁过度水解,菌体细胞暴露在外界环境中,与提取物苦参黄酮相互作用,导致菌体活性降低甚至死亡[44]。Bismelah等[45]报道了浓度为6.25 mg/mL的黄芩叶乙醇提取物处理变形链球菌后,通过扫描电镜发现,黄芩叶乙醇提取物诱导细胞伸长,细菌壁皱缩、被破坏,细胞壁通透性、胞外AKP活性增加,表明黄芩叶乙醇提取物是破坏菌体细胞壁来发挥抗菌作用,细胞裂解,提取物进入菌体细胞内部,导致细胞质渗漏,细胞死亡。Zhang等[46]报道了竹叶兰提取物中分离到的化合物作用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后,检测到AKP泄露,表明竹叶兰提取物的抑菌机制是使菌体细胞壁破裂,导致细菌死亡。Qin等[47]研究发现,经季铵化山楂果胶衍生物作用后,菌体生物膜合成率为未加药菌体生物膜合成率的60%～90%,推测抑菌机制是铵化山楂果胶衍生物通过正电荷与带负电荷的生物膜组分发生静电反应,导致生物膜被抑制。

3.1.4 通过阻碍菌体DNA合成实现抑菌效果

植物提取物抑制细菌DNA合成可分为3种情况,即提取物与DNA结合为复合物、破坏DNA双链结构和损伤菌体DNA。有研究发现,金黄色葡萄球菌DNA浓度会随着落叶松树皮原花青素(LBPC)提取物荧光光谱峰蓝移值变化而发生改变,菌体DNA存在时,LBPC提取物最大荧光发射峰被猝灭,浓度增加,猝灭程度随之增加,说明菌体DNA与LBPC提取物可能形成复合物[48]。还有试验显示,救必应水提取物与大肠杆菌作用后,大肠杆菌DNA复制量低于未加提取物的对照组,表明救必应水提取物可以抑制菌体遗传物质的合成[49]。郭海涛等[50]研究发现,经0.5、1.0倍MIC的榆栀水提取物处理后,大肠杆菌双链DNA含量均小于未加药的对照组,表明抑菌作用机制可能是榆栀水提物通过影响细菌DNA的合成达到抑菌功效。

DNA链正常构象即超卷曲双链闭环,植物提取物作用菌体后构象会出现断裂。Zheng等[51]研究发现,金银花水提物含量较高的绿原酸能够与常见金属离子形成配合物,配合物作用大肠杆菌后,该菌DNA由正常构象完整的超卷曲双链闭环分子消失转变为有缺口或线状链条,表明植物提取物通过切割完整DNA链成大或小的片段裂解DNA,达到抑制菌体的效果。碘化丙啶只在细胞裂解后才能对DNA进行染色,Kar等[52]通过凝胶电泳试验和显微镜观察,发现红木叶的70%乙醇-水提取物作用大肠杆菌后,菌体出现染色现象,DNA链出现向前端迁移的现象,表明植物提取物损伤了菌体的DNA。

除上述介绍的4种植物提取物对细菌的主要抑菌机制外,植物提取物还可以通过抑制菌体蛋白、毒力因子等实现抑菌效果。植物提取物的抑菌机制如表2所示。

表2 植物提取物的抑菌机制

3.2 植物提取物对动物细菌性腹泻疾病的治疗和预防机制

3.2.1 通过调整肠道菌群比例达到治疗和预防效果

肠道菌群可以维持动物机体组织稳定,在抵抗细菌导致的疾病中发挥重要作用。Jiang等[53]报道,饲粮中添加桉树叶提取物能够提高热应激下鸡回肠肠道菌群有益菌乳杆菌的比例,并降低致病菌沙门菌的比例。Zhu等[54]研究显示,口服黑果小檗水提物可以有效缓解大鼠腹泻,粪便中菌群数量发生明显变化,肠道病原体粪肠球菌、大肠杆菌数量下调,有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌数量上调。Yang等[55]研究发现,经植物提取物中药制剂香连丸处理后,恢复了抗生素相关性小鼠腹泻模型组肠道菌群丰富度和多样性,有效调节了菌群失调。Han等[56]报道,饲粮中添加葡萄籽提取物饲喂仔猪28 d后,有效增加了仔猪回肠、结肠微生物的多样性,达到了预防仔猪腹泻的效果。

3.2.2 通过保护结肠黏膜、抑制细菌黏附率达到治疗与预防效果

菌体对肠道细胞的黏附是对畜禽机体细胞损伤的第一步,添加植物提取物可有效降低黏附在肠道细胞上的菌体数量。如Xu等[57]发现,浓度为100～300 μg/mL的黄柏提取物作用大肠杆菌后,菌体对供试细胞猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)的黏附率降低,同时降低了大肠杆菌fae、faeG菌毛基因的正常表达,表明黄柏提取物对IPEC-J2细胞的治疗机制可能是通过减少菌体基因表达从而降低对细胞的黏附,导致大肠杆菌在猪小肠上皮细胞内定植减少。Famuyide等[58]研究发现,与未经处理的大肠杆菌对肠道Caco-2细胞黏附率相比,9种植物提取物均可降低细菌黏附率,大肠杆菌对细胞的黏附率下降了12%～88%;未经植物提取物作用的志贺氏菌导致腹泻大鼠肠道黏膜被破坏,表明植物提取物对Caco-2细胞的治疗机制是降低细菌对肠道细胞的黏附率,保护动物结肠黏膜。Fokam等[59]研究发现,显微镜下观察到经硬枝酢浆草水提物作用后,志贺氏痢疾菌感染组的大鼠结肠黏膜接近正常大鼠的结肠黏膜,表明硬枝酢浆草水提物具有防止结肠黏膜破坏的作用。

3.2.3 通过调节炎症和免疫功能达到治疗与预防效果

植物提取物可以通过抑制Toll样受体-4(TLR-4)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)等促炎因子的表达,促进白细胞介素-10(IL-10)等抗炎因子的表达来缓解细菌对细胞和机体的伤害,提高机体免疫力,有效治疗和预防细菌性腹泻病。有研究表明,蒲公英提取物联合益生菌能升高盲肠抗炎因子IL-10的表达,下调促炎因子TLR-4的表达,此结果与未感染前正常模型组基因一致,结果表明蒲公英提取物联合益生菌能通过调节炎症因子治疗肉鸡大肠杆菌感染[30]。中药制剂提取物香连丸能够降低小鼠结肠组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎因子的表达,处理后的腹泻小鼠结肠炎症水平更接近正常组小鼠结肠炎症水平[55]。研究显示,紫花苜蓿提取物中的多糖能够降低肉鸡盲肠黏膜中促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达,改善肉鸡的生长性能,促炎因子的下调与肉鸡小肠健康参数呈正相关[2]。

4 小结与展望

传统抗生素作为饲料添加剂已经被严令禁止。安全、低毒的植物提取物替代抗生素是目前的研究热点。植物提取物中的活性成分具有一定的抑菌活性和较好的应用前景。然而,目前饲料添加剂的研究主要集中在抑菌活性的考察,在分子水平上的抑菌机制研究还未系统进行。未来该领域的研究重点应放在以下几方面:1)分析抑菌活性好的植物提取物的活性成分差异,并探究其活性差异原因;2)针对饲料目录中具备较好抑菌活性的植物,系统地探究其抑菌机制;3)在分析植物提取物抑菌机制时,在生物膜、遗传物质被破坏基础上,需深入探究具体差异原因如次级代谢产物与靶点相互作用等;4)提高植物提取物活性成分的提取纯度或优化提取方法。综上所述,选取抑菌活性显著的植物,揭示其抑菌机制,对畜禽生产中减少抗生素使用、获取新型绿色饲料添加剂至关重要。