蠲痹方含药血清对绝经后膝骨关节炎大鼠软骨细胞自噬的影响及其作用机制

马靖哲,康武林,姚彬,黄文博,李越,陈小林,李思聪,袁普卫

(1.陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学药学院,陕西 咸阳 712046)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是一种以关节软骨退变、软骨下骨改变、滑膜炎症等为特征的慢性退行性疾病[1-3],主要表现为关节疼痛、僵硬和活动受限[4]。调查显示,我国40岁以上人群中女性KOA的患病率明显高于男性[5]。伴随着雌激素水平的下降,女性KOA的发病率呈陡增趋势[6]。骨关节炎的发病与炎症及软骨细胞外基质合成和降解的失衡密切相关[7-8]。软骨细胞外基质代谢异常可导致关节软骨细胞分解代谢加速[9]。自噬是维持细胞内环境稳定的重要过程,细胞可通过吞噬和降解功能失调的蛋白质与衰老受损的细胞器来维持自身的代谢需求[10]。软骨细胞自噬功能异常与KOA的发生密切相关,通过激活细胞自噬可以抑制软骨细胞的凋亡,延缓关节软骨退变[11]。蠲痹胶囊为陕西中医药大学附属医院院内制剂,在临床上用于KOA的治疗取得了满意的疗效[12-13]。本团队前期研究[14]证实,蠲痹胶囊治疗KOA的作用机制可能与降低滑膜中炎症因子的表达,抑制炎症反应有关。但该药对软骨细胞的影响,尚缺乏相关研究。我们根据蠲痹胶囊的组方药物制备蠲痹方含药血清,观察其对绝经后KOA大鼠软骨细胞自噬的影响,并对其作用机制进行了探讨,现总结报告如下。

1 实验材料

1.1 实验动物

8周龄SD雌性大鼠25只,体质量(200±30)g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004。实验动物于陕西中医药大学动物实验中心喂养,使用许可证号:SCXK(陕)2021-001。实验室温度18～25℃,相对湿度50%～80%,适应性饲养1周后开始实验。本研究实验方案经陕西中医药大学实验动物伦理委员会审查通过,伦理批件号:SUCMDL20220621002。

1.2 实验药物

蠲痹胶囊药物组成:熟地黄12 g、肉苁蓉10 g、骨碎补15 g、淫羊藿15 g、白芍12 g、生黄芪30 g、当归15 g、牛膝12 g、甘草片6 g。以上药物由陕西中医药大学附属医院药剂科提供。药物加水浸泡30 min,文火煎煮2次,2次煎煮的药液合并后,用100 ℃恒温水浴将药液加热浓缩至每毫升含生药1.0 g的蠲痹方药物浓缩液,4 ℃保存备用。

1.3 实验试剂

细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)-8购自北京博奥森生物科技有限公司,Compound C购自上海皓元生物医药科技有限公司,Ⅱ型胶原蛋白抗体购自常州市祥泰生物技术有限公司,G蛋白耦联受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)抗体购自美国Abcam公司,微管相关蛋白轻链3β(microtubule-associated protein light chain 3 beta,MAPLC3β)抗体、Beclin-1抗体、p62、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抗体、磷酸化AMP活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)抗体、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗体、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)抗体购自美国CST公司。

1.4 实验仪器

生物安全柜、CO2培养箱(新加坡ESCO公司),倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司),全自动酶标仪(美国ELX808公司),电泳仪(美国BIO-RAD公司),微量移液器(德国Eppendorf公司),YP601N电子天平(哈尔滨众汇衡器公司),3K15冷冻离心机(德国Sigma公司),Western Blot仪器(美国BIO-RAD公司),BG-gdsAUTO 710 MINI 发光成像仪(北京百晶生物公司)。

2 方 法

2.1 绝经后KOA动物模型建造

25只SD雌性大鼠,按照体质量由高至低排序,依次编号1～25。从随机数字表中随机选取1行随机数字,连续抄录25个随机数字与大鼠编号依次对应,将抄录的随机数字由大到小排序(随机数字相同则按照出现顺序排序)。对随机数字排序在前20位的大鼠,采用摘取卵巢及切断内侧副韧带、前交叉韧带,摘除内侧半月板的方法[15]进行绝经后KOA造模,其余大鼠不做处理。

2.2 蠲痹方含药血清制备

造模成功后,根据蠲痹胶囊成人口服剂量及成人和大鼠等效剂量公式[16]计算出大鼠用药剂量,按上述随机方法随机选取15只模型大鼠进行蠲痹方药物浓缩液(0.014 mL·g-1)灌胃,其余大鼠正常喂养。灌胃每日早晚各1次,连续7 d。末次给药1 h后腹主动脉取血,采集血浆,4 ℃下静置2 h后,于低温离心机4 ℃、3500 r·min-1(离心半径155 mm)离心 15 min。离心后转移至超净工作台内取上清液。将离心好的血清用移液枪转移到事先标记好的无菌离心管中,56 ℃水浴灭活30 min后用0.22 μm的滤膜过滤,移入无菌离心管中,置于-80 ℃冰箱内保存备用。

2.3 大鼠软骨细胞提取

采用过量麻醉法处死大鼠,取下大鼠整个膝关节,分别进行软骨细胞提取。将大鼠膝关节浸泡于75%乙醇中15 min后,转移至生物安全柜中。用手术剪剔除皮毛,暴露并打开膝关节,剥离膝关节表面的透明软骨层。将剥离的透明软骨层置于15 mL无菌离心管中,加入胰蛋白酶,于37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育30 min,然后用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化 3 h,过200目滤网,1500 r·min-1(离心半径155 mm)离心10 min。PBS缓冲液洗涤3次,收集细胞。模型大鼠和正常大鼠分别进行软骨细胞提取。

2.4 蠲痹方含药血清最佳作用浓度筛选

将模型大鼠软骨细胞以5000个·孔-1的浓度接种至96孔板,分为模型组及1.25%、2.5%、5%、10%、20%含药血清组6组,每组设3个复孔。待细胞贴壁后,除模型组用新鲜DMEM完全培养基培养外,其余组分别加入相应体积分数的蠲痹方含药血清进行干预。24 h后,参照CCK-8试剂盒说明,每孔避光加入CCK-8溶液10 μL,在培养箱内继续孵育1 h后,用酶标仪检测450 nm处的光密度。光密度值越高,细胞活力越强。

2.5 蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞GPR30表达影响的检测

将模型大鼠软骨细胞以5000个·孔-1的浓度接种至96孔板,分为模型组及1.25%、2.5%、5%、10%含药血清组,并取正常大鼠软骨细胞设为空白组,每组设3个复孔。除空白组和模型组用新鲜DMEM完全培养基培养外,其余组分别加入相应体积分数的蠲痹方含药血清进行干预。24 h后,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参蛋白,用蛋白免疫印迹法检测各组软骨细胞GPR30的相对表达量。

2.6 蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞自噬相关蛋白表达及AMPK/mTOR信号通路影响的检测

将模型大鼠软骨细胞以5000个·孔-1的浓度接种至96孔板,分为模型组、含药血清组、含药血清+Compound C组、Compound C组,并取正常大鼠软骨细胞设为空白组,每组每项实验设3个复孔。除模型组和空白组用新鲜DMEM完全培养基培养外,含药血清组、含药血清+Compound C组、Compound C组分别加入10%蠲痹方含药血清、10%蠲痹方含药血清+Compound C及Compound C进行干预。24 h后,采用蛋白免疫印迹法,GAPDH为内参蛋白,检测软骨细胞中自噬相关蛋白MAPLC3β、Beclin-1、p62的相对表达量;分别以AMPK、mTOR为内参蛋白检测AMPK/mTOR信号通路相关蛋白p-AMPK、p-mTOR的相对表达量。

2.7 数据统计

采用SPSS26.0统计软件处理数据。各组软骨细胞细胞活力、GPR30、MAPLC3β、Beclin-1、p62、p-AMPK、p-mTOR相对表达量的组间总体比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 动物模型鉴定结果

造模8周后,处死造模大鼠1只,见造模大鼠膝关节表面软骨毛糙或缺损,关节间隙变窄,滑膜增生,绝经后KOA大鼠模型造模成功。

3.2 软骨细胞鉴定结果

所提取的原代细胞,甲苯胺蓝染色见细胞浆呈浅蓝色,细胞核呈深蓝色[图1(1)];CollagenⅡ免疫荧光染色见细胞浆和细胞膜上有CollagenⅡ的特征性表达[图1(2)];鉴定为软骨细胞。

图1 大鼠软骨细胞染色图片

3.3 蠲痹方含药血清最佳作用浓度筛选结果

5组软骨细胞细胞活力的组间总体比较,差异有统计学意义(表1)。5%、10%、20%含药血清组细胞活力均高于1.25%、2.5%含药血清组和模型组(LSD-t=6.767,P=0.003,LSD-t=7.666,P=0.002,LSD-t=5.091,P=0.007;LSD-t=5.080,P=0.007,LSD-t=6.690,P=0.003,LSD-t=3.433,P=0.027;LSD-t=7.590,P=0.002,LSD-t=8.200,P=0.001,LSD-t=6.031,P=0.004);1.25%、2.5%含药血清组细胞活力与模型组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=1.182,P=0.303,LSD-t=1.785,P=0.187);10%含药血清组细胞活力高于5%含药血清组和20%含药血清组(LSD-t=3.204,P=0.033,LSD-t=4.671,P=0.010)。

表1 不同浓度蠲痹方含药血清干预后大鼠软骨细胞活力

3.4 蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞GPR30表达影响的检测结果 各组大鼠软骨细胞GPR30相对表达量组间总体比较,差异有统计学意义(表2、图2)。模型组GPR30相对表达量低于空白组及5%、10%含药血清组(LSD-t=5.695,P=0.005,LSD-t=5.400,P=0.006,LSD-t=9.006,P=0.001);模型组GPR30

表2 不同浓度蠲痹方含药血清干预后大鼠软骨细胞G蛋白耦联受体30的相对表达量

GPR30为G蛋白耦联受体30,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶,①为空白组,②为模型组,③为1.25%含药血清组,④为2.5%含药血清组,⑤为5%含药血清组,⑥为10%含药血清组。

相对表达量与1.25%、2.5%含药血清组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=0.776,P=0.481,LSD-t=1.585,P=0.170);5%、10%含药血清组GPR30相对表达量均高于1.25%含药血清组(LSD-t=2.782,P=0.049,LSD-t=4.473,P=0.011);10%含药血清组GPR30相对表达量高于2.5%含药血清组(LSD-t=4.544,P=0.011);5%含药血清组GPR30相对表达量与2.5%含药血清组比较,差异无统计学意义(LSD-t=2.521,P=0.065);5%、10%含药血清组GPR30相对表达量与空白组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=2.274,P=0.085,LSD-t=0.997,P=0.375);5%含药血清组GPR30相对表达量与10%含药血清组比较,差异无统计学意义(LSD-t=2.578,P=0.062)。

3.5 蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞自噬相关蛋白表达影响的检测结果

各组软骨细胞MAPLC3β、Beclin-1、p62相对表达量组间总体比较,差异均有统计学意义(表3、图3)。

表3 5组大鼠软骨细胞自噬相关蛋白的相对表达量

MAPLC3β为微管相关蛋白轻链3β,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶,①为空白组,②为模型组,③为含药血清组,④为含药血清+Compound C组,⑤为Compound C组。

p-AMPK为磷酸化AMP活化蛋白激酶,AMPK为AMP活化蛋白激酶,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p-mTOR为磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,①为空白组,②为模型组,③为含药血清组,④为含药血清+Compound C组,⑤为Compound C组。

模型组、含药血清+Compound C组、Compound C组MAPLC3β相对表达量均低于空白组、含药血清组(LSD-t=6.855,P=0.002,LSD-t=8.675,P=0.001;LSD-t=5.096,P=0.007,LSD-t=5.931,P=0.004;LSD-t=5.560,P=0.005,LSD-t=5.354,P=0.006);模型组、Compound C组MAPLC3β相对表达量均低于含药血清+Compound C组(LSD-t=4.627,P=0.010,LSD-t=8.677,P=0.001);模型组MAPLC3β相对表达量与Compound C组比较,组间差异无统计学意义(LSD-t=2.605,P=0.060);含药血清组MAPLC3β相对表达量与空白组比较,组间差异无统计学意义(LSD-t=1.677,P=0.169)。

模型组、Compound C组Beclin-1相对表达量低于空白组、含药血清组、含药血清+Compound C组(LSD-t=12.912,P=0.000,LSD-t=7.401,P=0.002,LSD-t=5.360,P=0.006;LSD-t=2.950,P=0.042,LSD-t=5.484,P=0.005,LSD-t=3.903,P=0.018);含药血清+Compound C组Beclin-1相对表达量低于空白组(LSD-t=26.840,P=0.000)。模型组Beclin-1相对表达量与Compound C组比较,组间差异无统计学意义(LSD-t=0.346,P=0.767);含药血清组Beclin-1相对表达量与含药血清+Compound C组、空白组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=4.648,P=0.358,LSD-t=1.032,P=0.361)。

含药血清组、空白组p62相对表达量低于模型组、含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=3.925,P=0.017,LSD-t=3.985,P=0.019,LSD-t=0.016,P=0.001;LSD-t=3.149,P=0.035,LSD-t=5.094,P=0.007,LSD-t=8.740,P=0.001),含药血清+Compound C组p62相对表达量低于Compound C组(LSD-t=3.455,P=0.026)。模型组p62相对表达量与含药血清+Compound C组、Compound C组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=0.787,P=0.476,LSD-t=1.565,P=0.193);空白组p62相对表达量与含药血清组比较,组间差异无统计学意义(LSD-t=1.972,P=0.120)。

3.6 蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞AMPK/mTOR信号通路影响的检测结果

5组软骨细胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR相对表达量组间总体比较,差异均有统计学意义(表4、图4)。

表4 5组大鼠软骨细胞AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的相对表达量

含药血清组p-AMPK相对表达量高于模型组、Compound C组(LSD-t=3.623,P=0.022,LSD-t=6.537,P=0.003),空白组p-AMPK相对表达量高于模型组、含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=4.149,P=0.014,LSD-t=2.791,P=0.049,LSD-t=5.734,P=0.004);含药血清+Compound C组p-AMPK相对表达量高于Compound C组(LSD-t=5.958,P=0.004)。模型组p-AMPK相对表达量与含药血清+Compound C组、Compound C组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=2.739,P=0.052,LSD-t=2.774,P=0.050);含药血清组p-AMPK相对表达量与空白组、含药血清+Compound C组比较,组间差异均无统计学意义(LSD-t=2.055,P=0.109,LSD-t=1.236,P=0.284)。

空白组、含药血清组、含药血清+Compound C组p-mTOR相对表达量均低于模型组(LSD-t=8.722,P=0.001,LSD-t=8.849,P=0.001,LSD-t=5.558,P=0.005);含药血清组、空白组p-mTOR相对表达量低于含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=4.201,P=0.014,LSD-t=10.030,P=0.001;LSD-t=4.879,P=0.008,LSD-t=9.782,P=0.001);含药血清+Compound C组p-mTOR相对表达量低于Compound C组(LSD-t=6.934,P=0.002)。模型组p-mTOR相对表达量与Compound C组比较,组间差异无统计学意义(LSD-t=1.476,P=0.214);含药血清组p-mTOR相对表达量与空白组比较,组间差异无统计学意义(LSD-t=1.708,P=0.150)。

4 讨 论

KOA属中医学“骨痹”“痹症”的范畴。《素问·上古天真论》曰:“女子七七,任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也。”绝经后KOA的内因为肝肾亏虚、精血不足,外因为风寒湿邪外侵,多为本虚标实之证[17]。蠲痹胶囊的药物组成由陕西省名老中医李堪印教授的临床经验方加减而得,具有补肾益气、舒筋通络之功效[18]。本研究结果表明蠲痹方含药血清可增强绝经后KOA大鼠软骨细胞的活力,最佳作用浓度为10%。

GPR30是一种7次跨膜G蛋白耦联雌激素受体,能介导快速细胞反应。成冬等[19]的研究表明,17β-雌二醇通过GPR30和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路保护ATDC5软骨细胞免于线粒体自噬。本研究结果表明蠲痹方含药血清可上调绝经后KOA大鼠软骨细胞GPR30的表达,最低作用浓度为5%。

软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型,炎症和氧化应激等病理因素可导致软骨细胞过度凋亡、细胞密度降低和细胞外基质降解,从而加速骨关节炎的发展。因此,预防软骨细胞过度凋亡可能是预防骨关节炎进展的有效方法[20]。细胞自噬是细胞内损坏的蛋白或细胞器经溶酶体降解成可循环利用的细胞成分的过程[21]。关节软骨细胞处于特殊的低氧环境中,营养物质缺乏,细胞自噬对于维持软骨细胞的生存和功能十分重要[22]。软骨细胞自噬活性降低,清除自身衰老、受损的细胞器的能力下降,细胞稳态被打破,代谢失衡,可致细胞发生炎性反应,出现细胞损伤。Luo等[23]的研究表明,自噬在维持关节软骨细胞的稳态中起着重要作用,软骨细胞自噬能力增强,可增强其基质代谢活性,从而延缓KOA的进展。细胞中自噬相关蛋白MAPLC3β、Beclin-1、p62的表达量可反映细胞自噬情况[24]。软骨细胞中MAPLC3β、Beclin-1的表达量上调,p62的表达量下调,说明细胞自噬能力增强。

AMPK是一种异源三聚体复合物,包含1个催化亚基α和2个调节亚基β和γ,每个亚基由2个或3个不同的基因编码,导致不同AMPK复合物有12种不同的α/β/γ组合[25]。AMPK能感知能量稳态调节因子三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的水平,当细胞ATP处于低水平时,AMPK可以通过调节代谢酶来对ATP与磷酸腺苷比率下降作出反应,以促进ATP的产生并抑制ATP的消耗[26]。当细胞能量较低时,α亚基中的Thr172被磷酸化,导致AMPK复合物的激活。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞自噬的过程中发挥着关键作用。mTOR有两种蛋白质复合物亚基,即mTOR复合体1和mTOR复合体2[27]。mTOR复合体1受生长因子调节,并对不利于细胞生长的环境(如DNA损伤、缺氧、低ATP水平和氨基酸耗尽等)作出反应,可促进细胞中脂质和核苷酸的合成,并通过促进葡萄糖代谢促进细胞生长[28]。mTOR复合体2主要通过磷酸化和激活蛋白激酶B来调节细胞增殖[26]。此外,mTOR复合体2通过磷酸化AGC蛋白激酶家族成员来控制细胞生长和代谢[28]。AMPK是自噬激活因子,mTOR复合体1是主要的自噬抑制因子。当AMPK激活后,可阻断mTOR信号通路的磷酸化,抑制细胞中mTOR的表达,增强AMPK和细胞自噬相关蛋白之间的相互作用,进而激活细胞自噬[29-30]。Li等[31]的研究表明,二甲双胍通过以AMPK介导的方式抑制mTOR信号通路,诱导细胞自噬,从而延缓H2O2诱导的脂肪间充质干细胞衰老。本研究结果表明,蠲痹方含药血清可上调绝经后KOA大鼠软骨细胞中AMPK磷酸化水平,下调mTOR磷酸化水平,引入AMPK抑制剂Compound C干预后,发现Compound C抑制了绝经后KOA大鼠软骨细胞的自噬并减弱了蠲痹方含药血清的作用。

本研究结果表明,蠲痹方含药血清作用于绝经后KOA大鼠软骨细胞,可增加细胞活力,并通过上调MAPLC3β、Beclin-1的表达和抑制p62的表达增强细胞自噬能力;其作用机制可能与促进GPR30表达,上调AMPK磷酸化水平,下调mTOR磷酸化水平,激活GPR30和AMPK/mTOR信号通路有关。本研究分别提取了正常大鼠与绝经后KOA模型大鼠的膝关节软骨细胞,由于未对2组大鼠软骨细胞的形态及炎症因子水平进行比较,不能确认所提取模型大鼠的软骨细胞完全反映了绝经后KOA软骨细胞的状态,但经鉴定所提取的细胞均为软骨细胞。未来的研究需要继续完善实验设计,进一步阐明蠲痹方含药血清影响绝经后KOA大鼠软骨细胞自噬的具体作用机制。