苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

韩鑫　郭金菊　张惠尧　吴廷全　张长远

摘    要：以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶（phytoene dehydrogenase，PDS）基因为靶标，构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板，同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明，McPDS基因CDS序列全长1731 bp，编码576个氨基酸，蛋白质相对分子质量为64.44 kD，理论等电点（PI）为7.09。跨膜结构分析结果表明，该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明，McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外，以McPDS为靶标基因，在5端筛选2个高特异性靶点，经设计引物，成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

关键词：苦瓜；McPDS；基因克隆；载体构建；基因编辑

中图分类号：S642.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）03-020-08

Cloning and CRISPR/Cas9 gene editing vector construction of McPDS in bitter gourd（Momordica charantia L.）

HAN Xin1， 2， GUO Jinju1， ZHANG Huiyao1， WU Tingquan1， ZHANG Changyuan1

（1. Institute of Facility Agriculture， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， Guangdong， China; 2. College of Horticulture & Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： A gRNA-specific CRISPR/Cas9 gene editing vector targeting phytoene dehydrogenase （PDS） gene of bitter gourd was constructed， hoping to lay a foundation for the establishment of CRISPR/Cas9 gene editing technology system of bitter gourd. In this study， the CDS region of McPDS gene was cloned from the leaf cDNA of bitter gourd inbred line B07. The results showed that the coding region length of McPDS was 1731 bp， encoded 576 amino acids，the theoretical relative molecular weight was 64.44 kD， and the theoretical isoelectric point（PI） was 7.09. The transmembrane structure analysis showed that the protein was a hydrophilic non-transmembrane protein. Phylogenetic analysis showed that McPDS had high homology with PDS proteins in cucurbit plants such as cucumber and melon. In addition， using McPDS as the target gene， two highly specific targets were screened at the 5' end， primers were designed， and a double-target CRISPR/Cas9 gene editing vector was successfully constructed， which laid a technical foundation for the establishment of bitter gourd gene editing system.

Key words： Bitter gourd；McPDS；Gene cloning；Vector construction；Gene editing

苦瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属（Momordica charantia L.）一年生攀缘草本植物，广泛分布在热带、亚热带和温带地区[1-3]。苦瓜药膳兼用，富含维生素、膳食纤维、粗蛋白、氨基酸等营养物质和皂苷、酚类、类黄酮、多糖等化合物[4]，具有降糖、降脂、抗病毒、防衰老等多种药理作用[5-6]，深受广大消费者青睐，市场前景广阔。

八氢番茄红素脱氢酶（phytoene dehydrogenase，PDS）是类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶，与ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）和类胡萝卜素异构酶（CRTISO）共同催化八氢番茄红素合成番茄红素，影响番茄红素及下游类胡萝卜素的生成[7-8]。PDS基因编码的蛋白主要位于叶绿体的类囊体膜上，对叶绿体具有光保护作用，其功能的缺失会导致叶绿素降解，造成光漂白现象[9]。由于该表型明显，易于观察，PDS基因常被用作报告基因，建立病毒诱导的基因沉默（VIGS）体系和基因编辑技术体系等，對基因功能研究和作物遗传改良具有重要意义[10]。

CRIPSR/Cas9系統是新近发展起来的一种高效、精准的基因组编辑技术，已成功应用于拟南芥、烟草和水稻等多个物种中，实现了基因定向编辑[11]。目前该技术正在被广泛应用于植物基因功能鉴定和品种改良等领域，具有广阔的应用前景。Zeng等[12]利用CRIPSR/Cas9系统对水稻的PIN5b、GS3和MYB30基因同时进行定点突变，获得的突变体分别表现出穗长增加、粒径增大和耐寒性增强等特点。Santosh等[13]利用CRISPR/Cas9方法在籼稻CV.MTU1010基因组中创建了突变等位基因DST?184-305，该基因有助于提高籼稻品种的耐旱耐盐性和产量。在番茄中，通过CRISPR/Cas9技术敲除SP5G、SlMYB12、AGL6等基因，可使果实产量快速提升[14]、高效获得粉红果色番茄[15]和无籽果实[16]。马存发等[17]利用CRISPR/Cas9技术敲除青花菜的BoSP11基因，创制了花期自交亲和材料。

目前，利用CRIPSR/Cas9系统对苦瓜基因进行定点编辑的研究还未见报道。笔者以苦瓜自交系B07叶片为试材，采用RT-PCR技术同源克隆苦瓜McPDS基因，对其编码蛋白的理化性质、结构特征及保守结构域等进行分析，并以该基因为靶标，利用CRIPSR/Cas9系统构建双靶点基因编辑载体，以期为苦瓜基因编辑体系的建立及农艺性状的定向改良奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用植物材料B07是由广东省农业科学院设施农业研究所选育的高世代、大顶类型苦瓜自交系，于2023年3月下旬种植于广东省农业科学院白云试验基地，常规管理。于幼苗四叶一心时，取其嫩叶立即放入液氮速冻，并于-80 ℃冰箱保存备用。

植物总RNA提取试剂盒SV Total RNA Isolation System Kit（Promega，美国），反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Kit（TaKaRa，日本），DNA凝胶回收试剂盒（TIANGEN，德国），pMD-19T Vector、T4 DNA连接酶（TaKaRa，日本），限制性内切酶BsaI（NEB，美国），质粒小提中量试剂盒（TIANGEN，德国），大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 McPDS基因克隆

提取苦瓜叶片总RNA，反转录合成cDNA。利用Primer Premier 5.0设计McPDS基因序列特异性引物，引物序列如下：McPDS-F：ATGTCACTATGTGGATCTGTCTCTG；McPDS-R：TCACCGAACGCCCGCCTCAGC。PCR反应体系（20 μL）：PrimeSTAR Max Premix （2X） 10 μL，引物McPDS-F/R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板（cDNA）1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸4 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶、纯化回收目的片段。

目的片段加A尾后连接至克隆载体pMD19-T。连接反应体系及条件：pMD19-T Vector 1 μL，目的片段4 μL，SolutionⅠ 5 μL，16 ℃连接30 min。采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含100 mg·mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16 h，筛选到的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3 McPDS蛋白生物信息学分析

利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线分析McPDS蛋白的理化性质；利用ProtScale（http：//web.expasy.or g/protscale/）对McPDS蛋白进行亲水性分析；通过在线软件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析McPDS蛋白的保守结构域；利用TMHMM 2.0 Server （TMHMM 2.0 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）分析McPDS蛋白跨膜结构；通过Signal P 4.1 Server （SignalP 4.1 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）预测McPDS蛋白信号肽；分别利用PRABI（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Swiss-Model（Swissmodel.expasy.org）预测McPDS蛋白的二级和三级结构；采用ClustalW和MEGA-X软件进行氨基酸多序列比对及系统进化树构建。

1.4 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

1.4.1 gRNA靶点选择和靶标引物设计 利用在线网站CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/）进行靶位点选择，最终筛选出2个靶位点，序列分别为：靶标1：GGAGAACAGCATCTCHAGGTTGG；靶标2：AAAGTAGTGATCGCTGGTGCAGG。根据靶点序列合成相应的靶点引物，序列如下：CrMcPDS-F：CAGTGGTCTCATGCAGGAGAACAGCATCTCGAGGT；CrMcPDS-R：CAGTGGTCTCAAAACGCACCAGCGATCACTACTTT。

1.4.2 CRISPR/Cas9表达载体构建 利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R扩增“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列，PCR反应体系（50 μL）：Biorun Pfu PCR Mix 25 μL，CrMcPDS-F 1 μL，CrMcPDS-R 1 μL，模板（SEQ1）1 μL，Nuclease-free Water 补足至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循环30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段经切胶、回收后，酶切连接至载体PHsbdcas9i，获得pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表达载体。酶切连接体系：10×Buffer 2 μL，BsaⅠ 1 μL，T4_ligase 1 μL，PHsbdcas9i 4 μL，胶回收产物 4 μL，Nuclease-free Water 补足至20 μL。反应条件：37 ℃ 20 min；37 ℃ 10 min，20 ℃ 10 min，循环5次；37 ℃ 20 min，80 ℃ 5 min。上述使用的模板SEQ1序列为：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca。

取5～10 μL连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态，将转化菌液涂布于卡那霉素抗性平皿中，37 ℃培养12 h，挑斑，利用引物zmpl-chen-F/zmpl-chen-R进行菌斑PCR，目的片段长度约800 bp。PCR反应体系（25 μL）：Biorun Magic PCR Mix 12.5 μL，M13F（100 μmol·L-1）1 μL，zmpl（100 μmol·L-1）1 μL，模板1 μL， Nuclease-free Water 补足至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循环30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。筛选到阳性克隆后，利用引物zmpl-chen-F进行测序，对测序正确的菌液提取质粒。引物序列为：zmpl-chen-F：gtaaaacgacggccagt；zmpl-chen-R：ccagaaattgaacgccgaag。

2 结果与分析

2.1 苦瓜叶片总RNA提取

利用植物总RNA提取试剂盒提取苦瓜叶片总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳获得2条清晰条带（图1），RNA质量浓度为366.534 ng·μL-1，A260/A280和A260/A230比值分别为2.18和2.27。结果表明，RNA纯度较高，完整性好，可用于后续试验。

2.2 苦瓜McPDS基因克隆

将上述提取的总RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用引物McPDS-F/McPDS-R进行PCR扩增，扩增条带约1700 bp，与预期结果一致，凝胶电泳结果如图2-A所示。对PCR产物进行凝胶回收，加A尾，连接至克隆载体pMD19-T，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含100 mg·L-1氨苄青霉素的LB固体培养基中，37 ℃培养箱中倒置培养16 h。挑取单菌落，37 ℃、200 r·min-1摇菌，PCR检测筛选阳性单克隆（图2-B），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

测序结果表明，该基因编码区长度1731 bp，編码576个氨基酸。在NCBI数据库BLAST比对结果表明，该基因编码的氨基酸与甜瓜PDS基因编码的氨基酸（NP_001284459.1）同源性高达93.58%，将该基因命名为McPDS。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 苦瓜McPDS蛋白理化性质分析 利用Protparam在线软件分析苦瓜McPDS蛋白理化性质，结果表明，苦瓜McPDS蛋白分子式为C2908H4568N772O829S26，相对分子质量为64.44 kDa，其带正、负电荷残基数均为69，理论等电点（PI）为7.09，表明苦瓜McPDS为中性蛋白。不稳定指数为44.05（>40），属不稳定蛋白。McPDS脂溶指数为92.08。

利用ProtScale对苦瓜McPDS进行蛋白亲/疏水性分析，总平均亲水性值为-0.154。一般而言，蛋白中氨基酸分值与其亲水性呈负相关。苦瓜McPDS蛋白氨基酸序列中第151位的分值最低（-2.667），亲水性值最强，而第111位因具最高分值（2.367），相应具最强的疏水性。苦瓜McPDS蛋白整个多肽链中亲水性氨基酸呈均匀分布，疏水性区域不明显，推测McPDS为亲水性蛋白。保守结构域预测分析结果表明，McPDS蛋白具有1个保守的PDS结构域（PLN02612）（图3）。

2.3.2 苦瓜McPDS蛋白跨膜结构分析 采用TMHMM 2.0 Server在线软件对苦瓜McPDS蛋白跨膜区进行预测，结果表明，McPDS蛋白无跨膜区，属非跨膜蛋白。SignalP-4.1预测结果显示，苦瓜McPDS蛋白存在信号肽的概率仅为0.45%，说明苦瓜McPDS为非分泌蛋白。

2.3.3 苦瓜McPDS蛋白二、三级结构预测 二级结构预测结果表明，苦瓜McPDS蛋白由41.32%的α-螺旋、38.89%的无规则卷曲、15.28%的延伸主链和4.51%的β-折叠组成（图4）。三级结构预测和同源建模分析表明，苦瓜McPDS基因编码的蛋白三级结构与番木瓜八氢番茄红素脱氢酶PDB ID：Q0PQZ4.1.A蛋白序列一致性高达83.33%，覆盖度为100%（图5）。

2.3.4 PDS蛋白多序列比对及系统进化分析 将McPDS基因编码的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST比对，结果表明，其与黄瓜、南瓜、甜瓜、冬瓜的同源性分别为95.1%、94.3%、94.1%、93.8%，同源性较高。利用ClustalX和MEGA-X软件，将McPDS基因编码的氨基酸序列与NCBI数据库中登录的15种植物中的PDS序列构建Neighbor-Joining（NJ）系统进化树。结果表明，苦瓜McPDS与甜瓜、黄瓜、冬瓜和南瓜等其他葫芦科作物的PDS蛋白聚为同一支，亲缘关系较近（图6）。

2.4 苦瓜McPDS基因编辑载体构建

利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R扩增gRNA表达盒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图7-A），目的片段纯化回收后，采用Golden Gate克隆法构建pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表达载体，采用热激法转化大肠杆菌DH5α，涂板，利用引物zmpl-chen-F/R检测阳性单克隆，目的片段大小约800 bp，与预期结果相符（图7-B）。阳性克隆测序结果表明，“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列成功连接至植物表达载体pHSbdcas9i（图7-C）。以上结果表明基因编辑载体pHSbdcas9i-Cr-PDS构建成功（图7-D）。

将pHSbdcas9i-Cr-PDS提取质粒，转化农杆菌GV3101，涂布于卡那霉素+利福平抗性的固体LB培养基中，菌落生长状态如图8-A所示。挑选出3个单克隆利用引物zmpl-chen-F/R进行PCR检测，扩增片段大小约800 bp，与预期结果相符（图8-B）。挑取阳性单克隆于卡那霉素+利福平抗性的液体LB培养基中培养1～2 d，按体积比1∶1加入60%甘油，于-80 ℃冰箱中保存，用于后续苦瓜遗传转化。

3 讨论与结论

基因编辑技术已经成为农业育种的主流方式，其中CRISPR/Cas9系统具有设计简单、编辑效率高，以及成本低等特点，广泛应用于作物育种研究中，在品质改良，提高产量，增强抗病、抗逆性等方面发挥着重要作用[18]。目前，CRISPR/Cas9系统已广泛应用于水稻[12]、大豆[19]、番茄[20]、西瓜[21]、香蕉[22]、柑橘[23]等作物的遗传改良。

八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是植物类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶，通过在植物体内积累八氢番茄红素来影响花、叶、果实中的类胡萝卜素含量[24-25]。PDS基因敲除或者功能丧失能够影响类胡萝卜素合成代谢，导致植株白化[9]，可以用来作为判定植物基因编辑技术体系是否成功建立的标记。舒海燕等[26]对菠萝八氢番茄红素脱氢酶基因Aco-PDS1进行定点编辑，突变株系的白化表型表明了Aco-PDS1基因成功进行了编辑突变，以此来判定菠萝CRISPR-Cas9系统的成功建立。胡春华等[22]利用CRISPR/Cas9系统定点敲除香蕉内源性八氢番茄红素脱氢酶基因，成功获得了香蕉白化突变株系。这些研究均表明了PDS基因在VIGS和CRISPR/Cas9等研究中的重要作用。

苦瓜作为重要的岭南特色瓜类蔬菜，分子生物学研究起步较晚，相比黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科作物，分子研究基础薄弱。截止到目前，尚未建立完善的苦瓜基因编辑体系。笔者以苦瓜自交系B07为材料，首次克隆出苦瓜McPDS基因，该基因cDNA序列全长为1731 bp，编码576个氨基酸。苦瓜McPDS基因编码的氨基酸序列与甜瓜、黄瓜、冬瓜和南瓜等其他葫芦科作物PDS蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性，均在80%以上，说明该基因在进化过程中较为保守。

笔者以McPDS为靶标基因，在5端编码区位置设计2个靶位点，通过Golden Gate方法构建了1个双靶点基因编辑载体。目前，基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑载体已在很多作物中成功构建。陈博雯等[27]构建了尾叶桉EuCAD基因的双靶点基因编辑载体，并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。由于苦瓜遗传转化体系尚不成熟，笔者构建的基因编辑载体pHSbdcas9i-Cr-PDS尚未进行基因编辑效率的验证，有待后续进一步研究。农杆菌介导法是目前植物中应用最为广泛的基因转化方法，具有操作简单、能稳定复制及表达等优势[28]。因此，利用本研究中构建的pHSbdcas9i-Cr-PDS编辑载体，通过农杆菌介导法建立苦瓜基因编辑体系，是后续研究的重点。

综上所述，笔者克隆了苦瓜McPDS基因，并成功构建了1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，填补了苦瓜在基因编辑研究方面的空白，为后续建立苦瓜基因编辑体系，并利用该体系研究苦瓜基因功能及定向改良苦瓜重要农艺性状奠定了技术基础。

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收稿日期：2023-11-27；修回日期：2024-01-12

基金项目：广东省农业科学院协同创新中心项目（XTXM202203）；广州市科技计划项目（202206010170，202201010493）；广东省自然科学基金项目（2022A1515010343）；广东省农业农村厅种业振兴行动专项（2022-NPY-00-027）；广东省农业科学院创新基金项目（202301）；广东省农业科学院学科团队建设项目（202130TD）

作者简介：韩    鑫，女，在读硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail：hanxin7026@163.com

通信作者：张长远，男，研究员，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail：zcy79130@163.com