电针对慢性束缚应激抑郁模型小鼠行为学的影响及机制研究*

张华敏,李江帆,邵 静

(1.河南中医药大学第一附属医院老年病科,河南 郑州 450000;2.北京中医药大学中医学院, 北京 100029)

针灸具有整体调节、多靶点干预及不良反应轻微等优势,而电针是传统针刺疗法的一种改进,在穴位插入针灸针并与电极相连,以脉冲电流刺激特定部位,调节某些身体机能并治疗疾病。抑郁症是一种常见的精神疾病,多项研究表明电针治疗抑郁症疗效较好[1-3],但其潜在的作用机制尚待阐明。抑郁症属中医学“郁证”范畴。郁者,滞而不通之义,故中医学认为郁证是由七情内伤、气机郁滞导致脏腑阴阳气血失调后形成的以情绪低落、意志力减退为主的一系列情志疾病的总称,发病机制与心、肝密切相关。本研究通过旷场实验和悬尾实验观察电针对慢性束缚应激 (chronic restraint stress,CRS)抑郁模型小鼠行为学的影响,通过c-Fos免疫荧光染色验证电针神门穴和太冲穴能诱导中枢神经系统内一些脑区的神经元激活,为电针抗抑郁提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

7周龄雄性C57BL/6J小鼠,体质量18～22 g,浙江维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号为SCXK(浙)2019-0001。小鼠饲养于独立通风笼具中,室温(23±2)℃,相对湿度50%～70%, 12 h昼夜节律(光照07:00—19:00)。除手术期间外,造模及行为学测试期间,小鼠均可自由获取灭菌水和营养饲料(北京科澳协力饲料有限公司产品)。实验结束后对小鼠进行断头处死并取脑。实验动物处置符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

1.2 主要试剂与仪器

驴血清,上海爱必信生物科技有限公司产品,批号abs935;Rabbit @c-Fos, 美国Cell Signaling Technology公司产品,批号Cat# 2250S;594 D@Rb,美国Invitrogen公司产品,批号Cat# A21207;抗荧光淬灭封片液,上海碧云天生物技术有限公司产品,批号p0131。太和牌针灸针,直径0.16 mm、长7 mm,北京中研太和医疗器械有限公司产品;SDZ-III型华佗电子针疗仪,苏州医疗用品厂有限公司产品;Smart 3.0小动物行为学分析系统,西班牙Panlab公司产品;BT100-2J型蠕动泵,保定兰格恒流泵有限公司产品;BXH-280型电热鼓风干燥箱,上海博讯医疗生物仪器产品;TS-2型数显脱色摇床,海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品;VT-1200 S型振动切片机,德国徕卡产品;VS200研究级全玻片扫描系统,仪景通株式会社产品;敞箱(40 cm × 40 cm × 40 cm)、悬尾检测仪(20 cm × 20 cm × 35 cm),上海梵碧智能科技有限公司产品;小鼠束缚器,黑龙江博睿达实验仪器经营部提供。

1.3 动物分组与实验设计

实验一:小鼠适应性喂养1周后进行实验,实验流程见图1。将小鼠按体质量随机分为正常组、假电针组、电针太冲穴组、电针神门穴组4组,每组8只。

图1 行为学实验流程图

实验二:小鼠适应性喂养1周后进行c-Fos免疫荧光染色实验,实验流程见图2。将小鼠按体质量随机分为假电针组、电针太冲穴组、电针神门穴组、穴位配伍(电针太冲穴+神门穴)组4组,每组8只。电针20 min,休息90 min,灌流取脑,进行后续的免疫荧光染色。

图2 c-Fos免疫组化实验流程图

1.4 模型的建立

小鼠适应性喂养1周后,参照既往文献[4-5]构建CRS抑郁模型。将小鼠置于固定在方形底座上的圆柱形透明束缚器(高10 cm、直径2.7 cm)内。为引导小鼠主动进入束缚器,在束缚器上面覆盖一条小毛巾,使束缚器内光线更暗。旋紧底盖,避免夹伤尾巴、脚趾和睾丸等。每天克制压力持续4 h,连续3周。正常组小鼠被轻柔抚摸2 min 后,在鼠笼里自由活动,且每天在同一时间禁食和水4 h。持续2周。2周后采用行为学测试(包括旷场实验和悬尾实验)判断造模是否成功。抑郁小鼠表现为敞箱内总运动距离缩短、中央区停留时间减少,悬尾实验中不动时间增加。

1.5 选穴与电针操作

参照《实验针灸学》[6]确定太冲穴、神门穴位置。太冲穴位于后肢足背第一和第二跖骨间凹陷处。神门穴位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘。分别用无菌毫针直刺电针太冲穴组、电针神门穴组小鼠双侧神门穴、太冲穴,深度2～3 mm,针柄连接华佗牌电针仪(频率2 Hz,电流强度1 mA,疏密波);针刺假电针组小鼠尾巴非穴位处,操作同电针组。均20 min/次,1次/d,连续治疗7 d。正常组可自由获得光照、食物和水,不做特殊处理。治疗期间保持环境安静。各组针刺位置和操作见图3。

图3 电针治疗示意图。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 行为学实验

分别在造模前、电针治疗前后进行,包括旷场实验和悬尾实验。

旷场实验(open field test,OFT): OFT是用于研究小鼠焦虑情绪行为和动机趋向特点的经典方法[7]。敞箱上盖敞开,在敞箱正中垂直上方1.5 m处设置固定摄像头;将小鼠放置于敞箱底板的中心方格(20 cm×20 cm)内,录制视频10 min;采用Smart I/O 3.0视频行为学分析软件分析。检测环境安静、隔音。将在旷场中移动10 min的总距离作为衡量运动能力的指标,将在空旷场地的中央区所停留的时间、在中央区穿越次数作为衡量焦虑行为的指标。高度焦虑的小鼠会逃避对旷场中央区域的探索,主要在周边区域活动。

悬尾实验(tail suspension test,TST):TST被广泛应用于评估抗抑郁药物的治疗效果[8]。其原理是小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱,从而放弃挣扎,显示“行为绝望”,进入特有的抑郁不动状态。房间灯光设置为暗淡(50 Lux)状态,将C57小鼠的尾巴(离尾尖约1 cm)粘在悬尾检测仪顶部挂钩上。为防止小鼠发生爬尾行为,悬挂之前在小鼠尾部套1个塑料管(直径0.5 cm、长3 cm)。悬挂后小鼠鼻尖距离设备地板约20 cm。悬挂小鼠6 min,用秒表手动记录后5 min内的不动时间。

1.6.2 基底外侧杏仁核脑区的c-Fos蛋白表达

c-Fos是神经细胞接受刺激时被迅速并短暂激活的基因,峰值在 90～120 min[9-10]。采用c-Fos免疫荧光染色的方法标记基底外侧杏仁核(basolateral amygdala, BLA)脑区在短暂时间窗内接受针刺太冲穴后被激活的情况。在针刺治疗结束后90 min,腹腔注射水合氯醛(7.5 μL/g体质量)深度麻醉小鼠;先后用生理盐水和 40 g/L 多聚甲醛经心灌注5 min;断头处死小鼠,取出鼠脑,放入40 g/L多聚甲醛溶液中,4 ℃冰箱固定12 h;用振动切片机制备40 μm厚冠状脑切片;将脑片转入驴血清中室温封闭1 h,孵育一抗(Rabbit@c-Fos, 1∶5 000)4 ℃冰箱过夜;次日在6孔板中加入5 mL磷酸缓冲盐溶液,室温振摇漂洗3次,每次10 min;将脑片转入装有二抗稀释液(594D@Rb, 1∶1 000)的2 mL微量离心管中,室温下避光孵育2 h;室温振摇漂洗3次,方法同前;贴片,滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚溶液染细胞核,并用指甲油封片。用VS 200全玻片扫描系统拍片,Image J软件进行阳性细胞计数,计算每0.1 mm2内c-Fos阳性细胞数目,取平均值。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠旷场实验结果对比

在基础状态下,4组之间旷场内总运动距离对比,差异无统计学意义(P>0.05)。造模2周,与正常组对比,假电针组、电针神门穴组和电针太冲穴组的总运动距离缩短,差异有统计学意义(P<0.01);旷场中央区停留时间减少 (P<0.05)。电针治疗后,与假电针组对比,两个电针组的总运动距离增加(P<0.01),且电针太冲穴组中央区停留时间增加(P<0.05),而电针神门穴组中央区停留时间无明显改善。结果表明,电针神门穴或太冲穴可逆转CRS诱导的小鼠抑郁样行为,且电针太冲穴效果更佳。见表1、表2。

表1 各组小鼠各时间点总运动距离对比

表2 各组小鼠各时间点旷场中央区停留时间对比

2.2 各组小鼠悬尾实验结果对比

基础状态下,4组之间不动时间对比,差异无统计学差异(P>0.05)。造模2周,与正常组对比,假电针组、电针神门穴组和电针太冲穴组的不动时间增加(P<0.05)。电针治疗后,与假电针组对比,两个电针组的不动时间减少(P<0.01)。结果表明,在神门穴或太冲穴处的电针治疗可以挽救CRS诱导的小鼠“行为绝望”。见表3。

表3 各组小鼠各时间点不动时间对比

2.3 各组小鼠BLA脑区的c-Fos激活情况对比

与假电针组对比,电针神门穴组、电针太冲穴组和穴位配伍组BLA脑区c-Fos表达增加(P<0.01);与电针神门穴组或电针太冲穴组对比,穴位配伍组BLA脑区c-Fos表达增加(P<0.01)。结果表明,电针太冲穴或神门穴发挥抗抑郁效应的机制可能跟激活BLA脑区相关。见表4。

表4 各组小鼠BLA脑区c-Fos表达对比

3 讨 论

本研究采用CRS应激模型符合人类“肝气郁结、神明受损”所致心境障碍。基于疏肝和调神的治则,选择具有宁心安神、疏肝解郁功效且既往研究证实可明显抗抑郁、改善认知的穴位:太冲,足厥阴肝经之原穴;神门(HT7),手少阴心经之原穴。《灵枢·九针十二原》[11]记载:“五脏有疾也,应出十二原”。《难经·六十六难》[12]曰:“五脏六腑之有病者,取其原也”。因此,脏腑发生疾病会反映于相应的原穴。针刺原穴能使三焦元气通达,调节脏腑经络功能,从而发挥维护正气、抗御病邪的作用。足厥阴肝经属多血少气之经,肝为脏之阴,主藏血,主疏泄。太冲穴是足厥阴肝经之原穴,具有疏肝理气、调和气血、调畅情志之功效,是治疗郁症的经验效穴。有研究者利用静息状态功能磁共振成像探讨针刺太冲作用机制,显示该穴主要特异性激活参与视觉功能、联想功能和情绪认知的脑功能网络[13]。神门穴是手少阴心经的原穴,心藏神,在志为喜,“喜则气和志达,荣卫通利”。《灵枢·官能》载:“用针之要,勿忘其神。”神门穴是神出入之门户,针刺神门可清心除烦,宁神开窍。有研究通过功能性磁共振成像技术观察单纯刺激神门激活的脑区为左侧额极区、左侧颞上回、左侧额下回等,主要对受试者的复杂情绪、认知、语言及逻辑产生影响[14]。目前,针刺抗抑郁的机制研究主要集中在突触和分子水平,对于其潜在的神经环路机制研究尚待进一步阐明。

本研究通过旷场实验和悬尾实验两种经典的抑郁行为学测试发现,与假电针对比,电针太冲穴和神门穴可明显改善小鼠抑郁样行为,且电针太冲穴效果较佳。上述结果表明,基于疏肝调神理论进行针刺可有效改善小鼠抑郁样行为。接下来,笔者进一步探索针刺发挥抗抑郁效应的作用机制,采用c-Fos免疫荧光染色的方法检测电针神门穴或太冲穴对经典的抑郁相关脑区BLA的激活情况。c-Fos作为一种神经元激活后迅速且大量表达的即刻早期基因被视为神经元激活的标志。c-Fos mRNA的峰值在30 min左右,c-Fos蛋白的峰值在90～120 min[15-16]。杏仁核是包括人类在内的复杂脊椎动物大脑颞叶内侧深处的两个杏仁状核簇,是大脑边缘系统的一部分,在记忆、决策和情绪反应(恐惧、焦虑或攻击性行为等)的处理过程中发挥着关键作用,且与其他大脑区域进行信息互通[17]。杏仁核的区域进一步细分为几个亚区,有基底外侧杏仁核、皮质核、内侧核、中央核等,分别具有不同的连接和功能特征。大量文献表明基底外侧杏仁核中的谷氨酸能神经元向伏隔核壳和核发送投射,这些预测驱动激励显著性的能力取决于多巴胺受体[18-19]。因此,本研究通过荧光免疫组化标记c-Fos阳性神经元来反映电针后短暂时间窗内杏仁核的激活情况。结果显示:与假电针对比,电针太冲穴或神门穴可诱导c-Fos的表达,当两个穴位配伍时c-Fos激活更为明显(P<0.01),提示基于疏肝调神理论的电针抗抑郁机制可能与激活杏仁核脑区相关。笔者接下来的研究方向是进一步通过病毒示踪技术找到杏仁核的输入和输出脑区,明确一条或几条潜在的神经环路,利用光/化学遗传学、光纤记录等手段深入探讨基底外侧杏仁核相关环路介导“疏肝调神”穴位配伍发挥抗抑郁效应的神经机制。