肿瘤相关巨噬细胞外泌体调控KRAS 信号通路影响胰腺癌细胞糖酵解功能

迪里夏提·阿力木,郑坚江,多力坤·吐拉哈孜,阿木提江·马合木提 （新疆维吾尔自治区人民医院肝胆胰医学诊疗中心，新疆 乌鲁木齐 830001）

胰腺癌是发病于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，其早期发病隐匿，缺乏诊断的标志物，患者生存时间短，被称为“癌中之王”，因此探究胰腺癌诊断的标志物和治疗的新靶点一直是研究的重点领域[1-2]。有研究指出，肿瘤相关巨噬细胞可调控胰腺癌的病理进程，包括肿瘤的生长和转移[3]。根据巨噬细胞的激活方式可分为M1 型和M2 型，其中M2 型巨噬细胞与肿瘤相关巨噬细胞表型及功能相似，因此常用于肿瘤相关巨噬细胞的体外研究[4]。Ye等[5]研究指出，肿瘤相关巨噬细胞能够通过调控CCL18/NF-κB/VCAM-1信号通路从而促进胰腺癌的转移。Wang 等[6]研究发现，肿瘤相关巨噬细胞亦可促进胰腺癌的免疫耐受。外泌体是多种细胞分泌的纳米级囊泡，肿瘤相关巨噬细胞可通过分泌外泌体调控胰腺癌血管新生、进展、耐药等[7-9]。高水平糖酵解是胰腺癌肿瘤微环境的特征之一，既可为肿瘤的生长提供ATP，又可创造利于肿瘤生长的酸性环境[10]。本研究探究了肿瘤相关巨噬细胞外泌体对胰腺癌细胞糖酵解的影响及机制，以期为胰腺癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞株CAPAN-2 和ASPC-1，人单核细胞THP-1 购自中国科学院上海细胞库；佛波酯、rhIL-4和rhIL-13 购自美国Sigma 公司；外泌体提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Lipofectamin 2000试剂盒购自美国Invitrogen 公司；CCK-8 试剂盒、葡萄糖摄取试剂盒购自美国Abcam 公司；TRIzol 和Prime Script RT Reagent 试剂盒购自日本Takara 公司；SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒购自美国Med Chemexpress 公司；乳酸检测试剂盒购自江苏KeyGEN Bio-TECH 公司；CD9、CD81、TSG101、KRAS、GAPDH 抗体及山羊抗兔IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

CAPAN-2 和ASPC-1 细胞培养于含10%胎牛血清DMEM 培养基中，THP-1 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，培养至细胞汇合度达80%时进行细胞传代。

M2 型巨噬细胞的诱导：THP-1 培养基更换为含150 nmol/L 佛波酯的培养基诱导72 h，使其分化为贴壁的M0 型巨噬细胞，所得M0 型巨噬细胞与20 μg/L rhIL-4 和20 μg/L rhIL-13 共培养，诱导72 h，使其分化为M2型巨噬细胞。

1.3 外泌体的提取与鉴定

收集M0 和M2 型巨噬细胞培养上清，将细胞上清液于4 ℃以3 000 g 离心10 min，取上清液，每1 mL 上清加入250 μL 的外泌体提取试剂，4 ℃静置2 h，以12 000 g 离心20 min，弃上清，所得外泌体（M0 exo和M2 exo）用500 μL 无菌PBS 重悬。使用透射电镜观察外泌体的结构，Western blot 检测外泌体标志物CD9、CD81、TSG101表达。

1.4 细胞转染与分组

将CAPAN-2 和ASPC-1 细胞分为PBS 组、M0 exo组、M2 exo 组、M2 exo+siKRAS 组。M0 exo 组和M2 exo组CAPAN-2、ASPC-1 细胞分别与10 μg/mL M0 exo 和10 μg/mL M2 exo 共孵育24 h，M2 exo+siKRAS 组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞转染KRAS siRNA 后与10 μg/mL M2 exo共孵育24 h，PBS组加入等体积PBS。按照Lipofectamin 2000 试剂盒说明书，将KRAS siRNA转染至CAPAN-2 和ASPC-1 细胞，转染48 h 后收集细胞进行后续研究。

1.5 细胞增殖实验

将PBS 组、M0 exo 组、M2 exo 组、M2 exo+siKRAS组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞接种于96 孔板中，每孔细胞密度为5×104/mL，每孔100 μL，按照细胞分组将细胞与等体积的PBS、10 μg/mL M0 exo、10 μg/mL M2 exo、转染KRAS siRNA+10 μg/mL M2 exo 共孵育24、48、72 h，在各时间点取出对应的96 孔板，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育4 h 后，使用酶标仪检测450 nm波长处各孔光密度（optical density，OD）值。

1.6 qRT-PCR

使用TRIzol 试剂盒提取各组巨噬细胞总RNA，使用Prime Script RT Reagent 试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒进行qRT-PCR 反应，反应条件为：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以GAPDH 为内参，使用2-ΔΔCt法检测各组细胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10表达，引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.7 葡萄糖的摄取实验

将各组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞接种至96 孔板中，每孔2 000 个细胞，待细胞贴壁后，PBS 清洗3 次，每孔更换为100 μL 含2%牛血清白蛋白的KRPH 溶液孵育30 min，再加入10 μL 2-DG 孵育20 min 后，加入80 μL 裂解液，分别于80 ℃孵育40 min，冰上孵育5 min，然后各孔加入10 μL 中和溶液，收集各孔上清液，加入10 μL 复合物A 溶液，37 ℃孵育1 h，然后加入等体积的中和缓冲液，混匀后使用酶标仪检测412 nm 波长处各孔的OD 值。根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线，计算各孔葡萄糖浓度，葡萄糖摄取率=（空白组葡萄糖含量-每孔剩余葡萄糖含量）/空白组葡萄糖含量×100%。

1.8 乳酸生成实验

收集各组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞培养上清，按照乳酸检测试剂盒说明书，每孔加入待测样品20 μL（标准管加入3 mmol/L的标准液20 μL，空白管加入PBS 20 μL）、酶工作液1 mL、试剂盒D 工作液200 μL，混合均匀后于37 ℃水浴10 min，然后每管加入2 μL的Buffer E 溶液，混匀后，使用酶标仪检测530 nm 波长处各孔的OD 值。乳酸含量=（待测样品OD 值-空白管OD值）/（标准品管OD 值-空白管OD 值）×样品测试前稀释倍数×3 mmol/L。

1.9 Western blot

RIPA试剂盒提取M0 exo、M2 exo和各组CAPAN-2和ASPC-1 细胞总蛋白，所得蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法转膜后，将PVDF 膜与CD9、CD81、TSG101、KRAS、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH 抗体于4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次后，以1∶10 000 的比例稀释山羊抗体IgG并室温孵育1 h，洗膜，使用ECL试剂盒显影。

1.10 统计学分析

使用Graphpad prism 7.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差（）表示，2 组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 M2型巨噬细胞诱导结果

与THP-1 细胞比较，M0 型巨噬细胞中iNOS、IL-12β、Arg-1 和IL-10 表达无显著变化（P>0.05），而M0+rhIL-4+rhIL-13 细胞中M1 型巨噬细胞标志蛋白iNOS和IL-12β表达显著下调（P<0.001），M2型巨噬细胞标志蛋白Arg-1 和IL-10 表达显著上调（P<0.001），见图1。说明rhIL-4 和rhIL-13 可诱导M2 型巨噬细胞的极化。

图1 qRT-PCR检测细胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10 mRNA表达

2.2 M2型巨噬细胞外泌体鉴定结果

提取的M0 exo 和M2 exo 均呈双层膜结构，粒径100 nm 左右，呈“杯托”样，并且均表达外泌体标志蛋白CD9、CD81、TSG101，符合外泌体的特征，见图2。

图2 M0 exo和M2 exo鉴定结果

2.3 M2型巨噬细胞外泌体促进胰腺癌细胞中KRAS/ERK1/2信号通路激活

与PBS组比较，M0 exo组CAPAN-2和ASPC-1细胞中KRAS 表达以及ERK1/2 磷酸化水平均无显著差异（P>0.05）；与M0 exo组和PBS组比较，M2 exo组CAPAN-2和ASPC-1细胞中KRAS表达显著增加（P<0.001），ERK1/2磷酸化水平显著升高（P<0.001），见图3。

图3 外泌体对CAPAN-2和ASPC-1细胞中KRAS/ERK1/2信号通路的影响

2.4 M2型巨噬细胞外泌体促进胰腺癌细胞增殖

与PBS 组比较，M0 exo 组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞增殖能力在24、48、72 h 均无显著变化（P>0.05）；M2 exo 组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞在24、48、72 h 的增殖能力均显著高于其他组（P<0.05），见图4。

图4 外泌体调控KRAS 对CAPAN-2 和ASPC-1 细胞增殖能力的影响

2.5 M2型巨噬细胞外泌体上调KRAS从而促进糖酵解

与PBS 组比较，M0 exo 组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞的葡萄糖摄取率与乳酸生成水平均无显著变化（P>0.05）；M2 exo 组CAPAN-2 和ASPC-1 细胞的葡萄糖摄取率与乳酸生成水平均显著高于其他组（P<0.001），见图5。

图5 外泌体调控KRAS对CAPAN-2和ASPC-1细胞糖酵解的影响

3 讨论

肿瘤相关巨噬细胞是一类肿瘤微环境中重要的免疫细胞，其表型和功能与M2 型巨噬细胞相似，具有促进肿瘤恶性生物学行为的功能[11]。Hwang 等[12]的研究指出，肿瘤相关巨噬细胞浸润的增加与非小细胞肺癌患者不良预后密切相关。D'Errico等[13]的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞可促进胰腺癌的转移。Kemp 等[14]的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞的水平能够反映胰腺癌患者全身免疫水平的变化。肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的调控是通过多种途径进行。Liu 等[15]的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞可通过分泌转化生长因子-β 而促进肿瘤的转移。越来越多的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞亦可通过分泌外泌体而调控胰腺癌的血管新生、进展、耐药等[7-9]。本研究将单核细胞THP-1诱导分化为M2 型巨噬细胞，用于肿瘤相关巨噬细胞的体外研究，并且提取M2 型巨噬细胞分泌的外泌体，将外泌体与胰腺癌细胞CAPAN-2 和ASPC-1 共孵育后发现，CAPAN-2 和ASPC-1 细胞的增殖能力显著增加。Wu等[16]也发现M2 型巨噬细胞外泌体可促进肝癌细胞生长。Wei 等[17]亦发现，M2 型巨噬细胞外泌体可促进肺腺癌细胞的生长。上述结果均说明M2 型巨噬细胞可促进肿瘤细胞的生长。

研究表明，KRAS 通路的异常活化与胰腺癌的病理进程密切相关，超过90%的胰腺癌患者均存在KRAS 基因突变，KRAS 异常活化会导致胰腺癌细胞的快速生长[18]。Diehl 等[19]的研究发现，KRAS/ERK 信号通路在胰腺癌中异常激活，靶向抑制ERK 可抑制KRAS 突变诱导的肿瘤生长。本研究将M2 型巨噬细胞外泌体与CAPAN-2 和ASPC-1 细胞共孵育后，CAPAN-2和ASPC-1细胞中KRAS 基因表达显著上调，ERK1/2 磷酸化水平亦显著升高，说明M2 型巨噬细胞外泌体可显著激活KRAS/ERK1/2信号通路。Katopodi等[20]的研究表明，KRAS 突变可促进肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的形成。Humpton 等[21]的研究表明，原癌基因KRAS 的表达可促进胰腺癌的生长。Dey等[22]的研究表明，KRAS 突变可诱导胰腺癌肿瘤微环境的代谢重编程。本研究发现，与M2 型巨噬细胞外泌体共孵育后，CAPAN-2 和ASPC-1 细胞糖酵解增加，抑制细胞中KRAS 的表达后，M2 型巨噬细胞外泌体对肿瘤细胞的糖酵解诱导能力显著下降，说明肿瘤相关巨噬细胞外泌体可通过诱导KRAS 信号通路而促进胰腺癌细胞的糖酵解。

综上所述，肿瘤相关巨噬细胞可通过分泌外泌体诱导KRAS/ERK 信号通路的激活而促进胰腺癌细胞的增殖和糖酵解。