壳聚糖温敏水凝胶在口腔相关组织工程的应用进展

库得来提·阿不都克力木 ,董红宾,多力昆·吾甫尔

自20世纪80年代第一次提出“组织工程”的概念后,因其打破外科“用创伤修复创伤”的传统观念,开创了通过“生物支架、干细胞、生长因子”结合修复创伤的新模式,从而受到生命科学界广泛关注[1]。这种新型模式通过在体外用预先构建一个有生物活性的植入体,并将其植入体内以修复组织缺损及缺损处的生理功能。壳聚糖优良的生物相容性、黏膜黏附性、生物降解性、形成三维多孔结构的能力,无毒性,易于处理和低成本优点等,使得壳聚糖成为一种合适的生物材料,并且在组织工程中具有巨大的应用潜力[2]。

1 水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶概述

水凝胶作为一种具有三维网络结构的交联聚合物,高密度的亲水基团可以保留大量的水或生物流体。并且其柔软和通透性优良的特点与细胞外基质相似,能为细胞提供一个运输营养和细胞增殖的平台,最大程度地减少对细胞组织的损害[3]。此外,水凝胶还具有良好的孔隙率,能够装载和释放各种药物,对于纤维化和坏死的组织具有清创和脱屑的能力。同时,水凝胶的特性随着缺损形态的不同而改变,决定了其在组织工程技术中广泛的应用前景[4]。Finklea等[5]研究人员成功地将人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)封装在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-纤维蛋白原微球水凝胶中,实现了对hiPSCs向功能性心肌细胞的引导和分化。值得一提的是,在分化的第8天,这些细胞已经具有了自发性的收缩,这将为心脏组织的再生和修复提供新的思路和方法。除此之外,水凝胶还广泛用于神经组织工程中。Grimaudo等[6]报道了一种基于N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(PHPMA)的水凝胶,该水凝胶用纤连蛋白Arg-Gly-Asp(RGD)进行功能化,模拟细胞外基质环境以绕过神经创伤后瘢痕愈合过程,并在体内大鼠脊髓中促进组织再生和支持轴突生长的能力,为神经创伤后的治疗提供了新的方向和希望。在抗肿瘤治疗方面,Lee等[7]设计了一种基于PEG聚合物凝胶的简单合成方法,将氨基甲酸酯键引入维生素E-PEG-维生素E共聚物的嵌段键中。这种方法形成的凝胶在体内稳定性较高,可以持续释放蛋白质达到17周以上,用于提供持续抗癌免疫的癌症预防疫苗中。水凝胶以其独特的条件敏感性、柔软通透性、药物载荷和释放能力在生物医学领域带来了更多的希望与可能。

壳聚糖(chitosan,CS)是由随机排列的β-(1,4)糖苷键连接D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖单元组成的线性多糖,其具有良好的抗菌性能与生物相容性,是目前发现的唯一的阳离子碱性多糖[8]。壳聚糖是通过对甲壳素进行脱乙酰化获得的,而甲壳素是一种大量存在于甲壳类动物外骨骼及真菌细胞壁上的结构多糖,其自然来源比较丰富。此外,壳聚糖的反应性还可以通过取代其官能团来改变自身结构,从而可以与其他生物材料进行合成或结合,形成生物复合材料。这些修饰使CS的特性得以调节,例如溶解度、生物降解性和机械性能等[9]。与此同时,CS的脱乙酰程度(degrees of deacetylation,DD%)也会影响到其复合材料的生物相容性。对壳聚糖/β-甘油磷酸盐水凝胶与降低DD%的壳聚糖的研究表明[10],低程度的脱乙酰提高了体外间充质干细胞(multipotent stromal cells,MSCs)的细胞活力,并明显减少了材料植入Wistar大鼠皮下后的白细胞浸润。

温敏水凝胶是一种温度敏感的水凝胶材料,其物理状态会随着环境温度的变化而发生改变,从而导致溶胶-凝胶状态的转变。当受到温度刺激时,这种具有温度敏感性的高分子聚合物会从分散的胶束状态转变为致密的三维网络结构,从而使凝胶形成并保持稳定的形态。当壳聚糖温敏水凝胶置入缺损后,在壳聚糖自身抗菌能力、生物相容性等特性的协同作用下,可以促进组织缺损的修复。与常规水凝胶相比,温敏水凝胶因其能随温度发生自身状态的变化而适应机体缺损的形态,在药物缓释载体、血管神经再生、组织工程等方面具有显著的优势[11]。

2 常见CS温敏水凝胶

2.1 壳聚糖/甘油磷酸钠温敏凝胶

壳聚糖/甘油磷酸钠(CS/GP)温敏水凝胶是由壳聚糖和甘油磷酸钠两种天然高分子材料交联形成的温敏型水凝胶。这种水凝胶的特点是其在室温下可以保持液态,同时随着温度升高,高于生理温度(37 ℃)时,水凝胶由液态变为固态。通过利用β-甘油磷酸盐用作壳聚糖温度敏感水凝胶的催化剂,并在适合的pH和生理温度下将壳聚糖溶液中的流体转化为凝胶相。这一变化的相关机制为:①壳聚糖链之间的氢键静电相互作用和疏水键相互作用;②壳聚糖的加入增加了离子强度,从而减少了壳聚糖链之间的静电排斥;③壳聚糖中的氨基反作用力和甘油磷酸中的磷酸基之间发生静电吸引[12]。在Rahmanian-Devin等[13]的研究中发现,β-甘油磷酸盐被认为是人骨髓干细胞培养基中的成骨因子,可导致骨髓干细胞向骨细胞分化。

2.2 壳聚糖/胶原水凝胶

胶原蛋白是机体中主要的细胞外基质蛋白,其功能是为反作用力提供机械支持,以抵抗最终的反复塑性形变。同时,胶原蛋白种类和纤维方向决定了组织中不同的细胞类型[14]。此外,胶原蛋白是动物体内中最丰富的蛋白质,其中富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等活性氨基酸。从生物学角度来看,胶原蛋白具有生物相容性和降解性突出、抗原性低等特点[15]。壳聚糖中添加的胶原蛋白可以获得类似于天然骨骼的仿生结构,增加钙和硫酸盐糖胺聚糖的产生,并具有成骨和软骨形成的潜力。这会使壳聚糖/胶原凝胶材料的机械性能得到了改善,同时显示出更高的耐酶降解性[16]。

2.3 壳聚糖/羟基丁基水凝胶

羟基丁基CS(hydroxybutyl chitosan,Hbcs)是最重要的CS醚之一,通过醚化反应将羟基丁基与CS骨架的羟基和氨基偶联而合成。Hbcs在水溶液中具有较低的临界溶液温度,约为19 ℃,且可在60 s内形成凝胶,是一种很有潜力的热敏聚合物[17]。Hbcs水凝胶具有良好的生物相容性和降解性,植入机体几周后会分解成无毒性的高度多孔结构,类似于细胞外基质的结构,有利于细胞的黏附与增殖。Dang等[18]评估了不同配方的Hbcs水凝胶作为可注射干细胞载体的潜力,用于输送治疗药物,以促进退化椎间盘的生物学重建。目前,基于Hbcs的水凝胶在组织工程领域备受关注。其应用涉及多个方面,其中最重要的是应用Hbcs水凝胶来模拟细胞外基质的三维环境,从而实现血管化的组织结构和器官的逐层构建[19]。除此之外,基于Hbcs的水凝胶还广泛应用于术后防粘连、伤口敷料、动脉栓塞剂、组织工程支架、药物传递和细胞治疗等领域,并且在临床实践中效果显著。

3 壳聚糖温敏水凝胶在组织工程中的应用

3.1 骨组织工程中的应用

3.1.1 颌面骨组织工程

作为颌面部的重要组成部分,颌骨在维持口颌系统的稳定性、咀嚼功能和面部外观方面具有关键作用。先天性异常、药物使用、局部炎症、牙周炎、创伤性损伤、恶性肿瘤和拔牙等原因都可能导致颌面部骨缺损[20]。为了恢复骨缺损,临床上常采用骨移植来恢复骨缺损,无论是自体骨移植还是异体骨移植都存在相应的缺陷。自体骨移植植骨区吸收且供区骨量不足、供区受创、感觉异常、功能受损、感染等问题,限制自体骨移植在临床上的应用[21]。而对于异体骨移植来说,也需要面对相应的免疫排斥、组织相容、疾病交叉传播,以及材料生物学或力学性能等方面潜在的问题。温敏水凝胶的良好物理性质和合适的生物降解性已被证明是一种有价值的骨替代材料,骨组织基质中的糖胺聚糖结构与壳聚糖分子结构相似,有利于成骨细胞的附着、生长、增殖和分化[22]。

Wu等[23]将小胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)添加到壳聚糖/β-甘油磷酸酯水凝胶(CS/β-GP)复合材料中,制备sEV/CS/β-GP水凝胶用于修复大鼠的颅骨缺陷。sEV是从细胞释放到细胞外环境中的外泌体和微囊泡。sEV在保护其内容物(mRNA、miRNA和蛋白质)免受降解以及将其内容物递送到细胞功能所需的受体细胞方面具有重要作用。实验中发现,sEV/CS/β-GP水凝胶植入受体区后,sEVs从水凝胶中成功释放,同时水凝胶的热敏性提高了骨愈合能力,促进了颅骨缺损的修复。此外,sEV/CS/β-GP水凝胶还能够促进血管生成和骨形成,从而为骨组织再生提供了良好的基质和支持。

在Pankongadisak等[24]的研究中,将丝胶蛋白(silk sericin,SS)加入CS/β-GP水凝胶后,可以明显减少水凝胶的凝固时间并且加速水凝胶凝固的同时,还能释放出更多的酚类化合物,提高水凝胶恢复功能性骨组织的潜力。与此同时,根据近期研究证实生物活性玻璃纳米颗粒(bioactive glass nanoparticles,nBG)在骨组织工程技术中具有广泛的应用前景。Moreira等[25]制备了壳聚糖/明胶/生物活性玻璃纳米复合水凝胶(CH/GE/nBG hydrogels)并研究了该水凝胶对骨细胞再生效率的影响,发现该水凝胶促骨再生潜力优良,对骨细胞及组织没有明显毒性,生物相容性良好,为组织工程技术修复颌面骨缺损奠定了坚实基础。

3.1.2 牙周骨组织工程

在修复牙周骨缺损方面,壳聚糖不仅可以作为组织工程支架和控制递送载体,还具有良好的抗菌性能,对细菌或真菌具有杀菌作用[25]。重要的是,在室温条件下,温敏型水凝胶可以保持液体状态,更有利于针对性地应用于通常难以触及的深牙周袋。在Zang等[26]的研究中,他们将具有骨成骨细胞分化和牙周组织愈合的潜力的BMP-7生长因子(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)与奥硝唑(ornidazole,ORN)加载于CS/β-GP水凝胶,并且置入于比格犬的Ⅲ度根分叉病变中,术后发现所有水凝胶都形成了高度多孔的结构,这种结构利于营养物质的均匀分布及细胞的黏附增殖,促进牙周组织中血管和骨组织的再生。同时BMP-7以稳定和持续的方式从CS/β-GP水凝胶中释放,刺激着成骨细胞增殖和分化,ORN又确保了水凝胶的抗菌性能,这些将使得根分叉病变附近有大量骨组织及牙骨质再生,并且周围还有会有丰富的胶原纤维形成。这些实验也证明了壳聚糖温敏水凝胶通过成为组织工程支架及药物缓释系统在牙周再生工程的优势及应用潜力。

3.2 软组织工程中的应用

近年来,随着对壳聚糖及壳聚糖温敏水凝胶及其衍生物的进一步了解,壳聚糖也越来越多的应用于软组织工程之中,例如牙髓-牙本质复合体再生、牙周软组织再生及颌面部血管神经再生等。对于牙髓再生来说,由于牙髓系统是一种高度血管化和神经组织支配的复杂结构,因此牙本质-牙髓再生一直被认为是一个巨大的挑战[27]。根据Wu等[28]的最新研究报告,使用壳聚糖/β-甘油磷酸盐(CS/β-GP)水凝胶作为缓冲系统负载具有促进牙本质再生的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并探讨了其对牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)的影响。研究发现CS/β-GP水凝胶对DPSC无细胞毒性,它还具有促进DPSC扩散、利于细胞分布的特点。同时,从后期矿化活性检测及牙源性标志物的表达观察,VEGF/CS/β-GP水凝胶可以持续释放VEGF,并有助于DPSCs的牙源性分化及血管源性分化。因此,VEGF/CS/β-GP水凝胶可能成为牙髓及血管再生组织工程中具有潜力载体材料。另一方面,对于壳聚糖水凝胶的抗龋应用,在Ruan等[29]进行的一项研究中,通过将脱乙酰化75%壳聚糖与从重组DNA技术获得的纯化釉原蛋白rP172混合制备釉原蛋白-壳聚糖水凝胶(amelogenin-chitosan,CS-AMEL)作再为矿化剂用于再矿化侵袭性病变或类似龋齿病变的人类牙釉质。结果表明,CS-AMEL水凝胶有效地在具有侵袭性类龋病变表面形成了有组织的牙釉质状晶体层。它还可以通过再生有组织的晶体来修复早期病变,并减少病变的深度。

壳聚糖温敏水凝胶单独载药或与生长因子协同使用,为牙周软组织再生治疗提供了可行有效的新方案。Huang等[30]将具有良好抗菌性的氧化锌纳米颗粒(ZnO-NPs)负载于CS/β-GP温敏水凝胶之中,发现ZnO-NPs/CS/β-GP水凝胶对钛种植体周围的牙龈卟啉单胞菌生物膜有明显的抑制作用。同时,抗菌水凝胶可以吸收植体周围组织渗出物,抑制生物膜形成,有利于恢复种植体周围软组织水平。Ammar等[31]通过将牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)置入冻干血小板浓缩物(freeze-dried platelet concentrate,FDPC)加入CS/β-GP温敏水凝胶进行培养,培养2周后观察PDLSC的活力。经实验证实,在水凝胶中加入FDPC后可以显著提高了PDLSC的活力,并且与体外标准基培养的PDLSC细胞活力相当。

神经再生组织工程领域正在密切关注一种新兴治疗方案,该方案利用口腔环境中易获得的口腔间质干细胞,通过引导其定向分化来修复相关神经组织缺损。Cai等[32]使用壳聚糖温敏水凝胶(CS/β-GP)作为培养支架,通过在水凝胶中嵌入表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管内皮生长因子等生长因子及二甲双胍对人牙龈间充质干细胞(human gingival mesenchymal stem cells,hGMSCs)进行分化培养。研究发现,hGMSCs在负载二甲双胍的壳聚糖温敏水凝胶及生长因子的诱导下,表现出了功能性神经元样的分化潜力,并探究了hGMSC最合适的生长和神经分化条件,为温敏水凝胶联合hGMSCs实现神经再生提供依据。

4 结 语

作为一种具有独特特性和在生物医学中广泛应用的生物聚合物,壳聚糖及其衍生物一直受到各学科的广泛关注。目前,研究中主要是通过将壳聚糖与其他天然或合成聚合物进行结合,从而改善其生物相容性及物理化学性能,降低其生物降解速率。同时,将生物活性因子、药物或种子细胞与CS温敏水凝胶复合诱导组织。重要的是,根据体内及体外研究结果表明,温敏水凝胶支架大多数不但没有细胞毒性,而且还能促进体内细胞的附着增殖,有利于机体组织的修复。

尽管在目前的临床实践中,CS温敏水凝胶是一种可能的骨缺损修复替代材料,但是仍存在一些局限性:①由于机体内器官和组织的复杂性,由单一聚合物制成的壳聚糖水凝胶并不总能满足所有要求。②用于骨再生的壳聚糖基材料的表征尚未得到标准化。虽然有许多关于壳聚糖支架作为潜在骨再生材料的研究,但使用的表征方法各不相同,这使得无法正确比较不同研究的结果并对材料的潜力得出最终结论。③如何控制水凝胶缓释系统对释放生物活性因子或药物的释放速度及释放效能,以及如何降低分子材料自身可能引发的潜在炎症反应对组织再生修复的不良影响等问题仍待解决。因此,未来壳聚糖温敏水凝胶的研究重点可能会在优化壳聚糖表征的同时,能与多种生物活性因子相结合,获得具有“智能”控制载体释放及多层次修复组织缺损能力的新型CS温敏水凝胶。

综上所述,随着对壳聚糖温敏水凝胶的研究不断深入和材料科学的不断发展,相信未来壳聚糖温敏水凝胶将能够为口腔组织再生领域提供更为多样化和精准化的治疗方案。