皂苷源土壤连作障碍的成因及生物炭修复缓解机制研究进展*

王薛梅 计丕霞 芦 梦 陈 全 吴 敏 潘 波

(昆明理工大学环境科学与工程学院,云南省土壤固碳与污染控制重点实验室,云南 昆明 650500)

我国拥有悠久的土地耕种历史,但目前耕地退化及连作障碍严重[1]。其中,化感物质例如皂苷的化感自毒作用、土壤理化性状的恶化和土壤微生态环境的失衡是导致耕地退化及连作障碍的三大主要因素[2]242,[3-4]。三者之间还会相互影响,进一步加剧连作障碍,其中土壤中积累的化感物质对植物造成的化感及自毒作用、对病原菌等土壤微生物的影响被认为是主要原因[2]242,[5-6]。许多药用植物在生长过程中会通过根系分泌、淋溶、挥发及残株腐解等形式向外界环境释放皂苷类化感物质[7-8],如人参、西洋参、三七等分泌的人参皂苷,柴胡、紫花苜宿以及甘草中的柴胡皂苷、苜宿皂苷和甘草酸等。这些分泌皂苷的植物几乎都是传统的名贵中药材,具有重要的药用价值和极大的市场需求[9]1。然而,过密、连续、单一的种植模式导致皂苷在土壤中大量积累,加之土壤养分失衡、理化性质恶化等原因严重制约了药用植物的大规模可持续生产[10-11]。因此,缓解防治土壤连作障碍已经成为亟待解决的问题。

目前已有措施通过调节生物条件和环境因素来缓解皂苷积累引发的连作障碍。有研究证实恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)将皂苷作为生长所需碳源降解,对其具有高利用率和解毒率[12]。但是外加菌株很大程度上会受到本土微生物的影响,对消减皂苷的效果不稳定,环境依赖性较大[13]16。作物的轮作套作是目前田间防控连作障碍最常见的手段,但即便如此往往也需要10年左右才能使三七类药用植物再植成功,且土壤仍然面临着肥力降低、质量退化和微生物失衡等问题,此外长期的土壤闲置也难以满足当前日益增长的农业市场和土地资源的需求[14]。土壤灭菌消毒也是有效防治连作障碍的手段之一,如:化学试剂消毒[15],[16]843和蒸气消毒均可提高三七的存苗率,促进三七的生长发育。但化学试剂消毒可能因其残留而对土壤、作物和微生物带来环境风险[17]190;蒸汽消毒的土壤约45 d后,微生物会二次定植,这就极易导致病原微生物再次大量富集,对作物后续生长发育造成负面影响[18]。土壤强还原处理(RSD)构建的厌氧还原型土壤环境,被证实能有效降解三七分泌的各类皂苷,抑制病原菌的生长。但单一的RSD不能彻底消减土壤中影响三七生长的两大障碍因子(皂苷和病原菌),因此随着再植时间的延长,三七的死亡率会逐渐增大,仍然无法满足实际的农业生产需求[13]16。这些防治措施都无法在短时间内达到有效稳定且环境友好的修复效果,且无法从源头上遏制皂苷的产生。因此,目前迫切需要一种新的方法来调控土壤中皂苷类化感物质的产生和积累,从而缓解其诱发的连作障碍。

作为一种土壤改良剂,生物炭能有效吸附降解土壤中的污染物、改善土壤肥力、促进植物生长、改善土壤微生态环境[19-20]。生物炭的比表面积及孔隙结构、表面含氧官能团的种类及分布、离子交换能力、持久性自由基等在其发挥效用过程中起着关键作用[21]。针对皂苷源土壤连作障碍,研究者有针对性地衍生出一系列生物炭改性手段,包括物理、化学、生物改性和材料负载等[22]。改性后的生物炭孔隙更加丰富,比表面积增大,能定向负载官能团,对不同有机污染物的吸附去除能力大大提升的同时,施用到土壤中能有针对性地改善土壤理化性质及土壤微生态环境[23]404。

笔者综述了由皂苷积累为诱因引发的药用植物连作障碍成因,同时论述了生物炭如何通过吸附降解皂苷、改善土壤理化性质、改善土壤微生态环境等方式对修复皂苷源土壤连作障碍产生积极作用,并对生物炭的改性提出探讨。最后展望了还原剂改性生物炭对修复皂苷源土壤的前景,为克服药用植物连作障碍提供理论支撑。

1 皂苷通过影响植物与微生物生长引发土壤连作障碍

1.1 皂苷对植物的化感以及自毒作用机理

皂苷类化感物质对植物的化感及自毒作用主要表现为通过对植物造成氧化胁迫、影响植物光合作用、破坏植物细胞结构、干扰植物激素分泌等方式改变植物生理功能,从而影响植物的正常生长发育。

近年来,皂苷类物质对植物体抗氧化系统的影响得到了大量研究与证实,被认为是化感作用的重要机制之一[13]11。稳定的活性氧(ROS)代谢在高等植物的生长、发育和对非生物环境胁迫以及细胞程序性死亡等过程中发挥着重要的信号作用[24]。而化感物质胁迫会诱发植物体内ROS的产生和积累[25],使细胞膜迅速去极化、膜通透性增大,导致膜脂过氧化损伤[26]。已有研究表明人参皂苷Rg1能通过抑制抗坏血酸过氧化物酶、参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环的酶活性诱导三七根细胞中ROS(O2-和H2O2)的积累,破坏三七根尖细胞内抗氧化系统平衡,从而导致根细胞死亡[27]5。100 mg/L人参皂苷Rb1就能使植株积累ROS和丙二醛(MDA),对液泡膜、细胞核等细胞器造成损伤,从而导致细胞质壁分离[28]2506。

光合作用作为植物赖以生存的基础,是植物维持正常生长发育所需能量的重要来源[13]11。化感物质能通过与植物体光合作用过程中光系统Ⅱ(PSⅡ)组分相互作用来抑制植物光合作用和氧气释放[29-31]。有研究表明,不同种类的皂苷协同作用会导致三七幼苗叶片中表征PSⅡ反应中心运转情况的重要指标F0升高[13]11,而F0升高往往意味着PSⅡ反应中心受到破坏或者失活[32]。此外,有学者在营养液中添加低浓度人参总皂苷,发现其对西洋参叶片净光合速率也有抑制作用[33]。

皂苷类化感物质还能破坏植物细胞结构。例如,三七幼苗的根细胞在总皂苷和人参皂苷Rb1的作用下发生细胞壁分离、细胞核扭曲变形[28]2506;在人参皂苷Rg1的作用下,与膜蛋白相关的10种基因表达水平显著上调[27]10。其中,跨膜蛋白相关基因表达水平的上调被认为与内质网应激诱导的细胞凋亡有关[34]。

植物激素在植物应对各种生物和非生物胁迫的生长发育过程中,发挥着重要的信号调节作用[35]。吲哚乙酸(IAA)的主要生理功能是促进植物细胞和器官的生长,促进细胞分裂。而化感物质可以通过控制IAA酶灭活IAA,破坏植物体内激素平衡。不同浓度的皂苷会影响再植人参幼苗体内部分植物激素,如IAA、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)等的表达量,从而对人参幼苗生长产生化感抑制作用[36]。

1.2 影响土壤微生物群落多样性

皂苷类化感物质在土壤中积累,不仅会对植物的生长发育产生化感抑制效应,还会影响土壤微生物的群落结构、功能多样性和分布情况[13]12,[37]。土壤中的微生物在养分循环、有机质分解和保持土壤肥力等方面都发挥着至关重要的作用[38]。在作物连作障碍的成因统计中,种植土壤微生态环境失衡占比高达85%,被认为与土传病息息相关[39]。

1.2.1 皂苷对土壤中细菌群落的影响

细菌群落的组成、结构、功能多样性不仅是衡量土壤肥力和健康的重要标志,还与连作过程中植物生长发育有着密切关联。在许多药用植物连作的土壤中,细菌群落多样性总体呈现先升高后降低的趋势。这是因为连作初期,特异性根系分泌物皂苷能为微生物提供碳源和氮源等营养成分,对土壤微生物群落的组成和结构有化感促进作用,而不断积累的皂苷对土壤中细菌的定向化感作用也越来越强,使得特定的细菌群逐渐占据主导地位,细菌群落多样性也随之降低[40-41]。在未种植过的土壤中外加低浓度的人参皂苷Rg1、Rb1、Rh1,短时间内改变了土壤细菌群落多样性、提升了微生物群落碳源代谢能力和功能多样性,二乙酸荧光素(FAD)水解酶活性也显著升高。而高浓度人参总皂苷处理后的土壤中,反映微生物群落丰富度的ACE指数、物种总数的Chao指数以及微生物群落多样性的Shannon指数都显著低于未处理组,且处理时间越长,细菌在门和科水平上丰度相较于对照组就越低。此外,在各类皂苷处理下,土壤中变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)细菌的比值显著降低,丰富的营养条件更有利于变形菌门种群的扩张[42],酸杆菌门则更易在营养贫瘠的环境中大量富集[43]。这也侧面反映了皂苷类物质能定向刺激微生物类群对土壤中营养成分的偏耗,使土壤营养环境趋向恶化[13]13。

1.2.2 皂苷对土壤中真菌群落的影响

引发药用植物感染土传病的病原菌大多数是真菌,皂苷对土壤中真菌群落的影响主要集中在降低真菌群落多样性、促进病原菌富集、抑制有益功能菌生长3个方面。皂苷处理的土壤中,真菌群落在属水平上发生了显著改变,而在门和纲的水平上与对照组差异不明显。随着处理浓度和时间的增加土壤真菌的丰度随之降低[13]44。皂苷对病原菌的化感促进作用是引发土传病,导致连作障碍的主要原因之一。镰刀菌属(Fusarium)中尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlechtendal)、腐皮镰刀菌(HaematonectriaHaematococca)以及粉红粘帚霉属(Gliocladiumroseum)真菌被认为是引发三七根腐病的主要病原真菌。在不同皂苷(单体质量浓度22.5 μg/mL)处理的健康土壤中镰刀菌属的相对丰度分别为0.72%(Rg1)、0.91%(Rb1)、2.90%(Rh1),其丰度较对照(0.50%)都显著增加,各种皂苷混合处理组中其相对丰度更是增加到了7.33%[13]66。从西洋参和三七中提取的皂苷也被证实对不规则腐霉(Pythiumirregulare)[44]、恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)[45]、破坏性腐霉(I.destructans)[46]、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)[47]等病原菌的生长有明显促进作用。一方面,皂苷类化感物质能通过对真菌膜的结构或功能产生影响来刺激病原菌的生长和富集。如:皂苷类化合物对尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子萌发有显著的化感促进作用[13]67。另一方面许多致病菌,例如导致三七根腐病的主要病菌I.mors-panacisG3B和F.solaniDRF1能将皂苷作为自身代谢碳源将其降解[48]56。在促进病原菌富集的同时,皂苷类化合物还能抑制土壤中有益真菌的生长。枝顶孢属(Acremonium)真菌可以诱导激发植物产生系统抗性,有效降低番茄、亚麻等植物的枯萎病病发率,对三七根腐病病原菌也具有抗菌活性[49],而枝顶孢属在皂苷处理组中丰度下降显著[13]69。

2 生物炭对皂苷分泌或降解的调控可有效缓解土壤连作障碍

作为一种优良的土壤改良剂,生物炭不仅能吸附降解皂苷,减少其在土壤中的累积[16]843;还能通过调节土壤理化性质、改善土壤微生态环境,从源头上有效调控植物对皂苷的分泌[17]190,如图1所示。

图1 生物炭缓解皂苷源土壤连作障碍机理图

2.1 生物炭对化感物质的吸附作用

生物炭具有较大的孔隙结构、比表面积和丰富的含氧官能团,因而在吸附污染物方面呈现出巨大潜力。已有研究表明,将不同量的生物炭(4、8、12 g/L)添加到施加外源皂苷(100 mg/L人参皂苷R1、Rb1、Rd、Re、Rg1、Rh1、Rf和Rg2混合液)的未植土壤中后,生物炭能显著吸附其中的人参皂苷(其中人参皂苷Rb1和Rf在3种生物炭添加量下被吸附率均高达到100%);在水培条件下生物炭也可以有效吸附三七分泌的皂苷,显著提高三七的存苗率[17]190,[50]。生物炭吸附皂苷的机理主要包括π键作用、孔隙填充、静电吸附作用等,其含氧官能团数量、比表面积大小、孔隙率高低往往与其对污染物的吸附容量呈正比[51]。生物炭上含氧官能团可以与皂苷形成电子-给体-受体复合物以吸附皂苷,生物炭的稠芳环结构还能与具有环状芳香性萜类化合物的皂苷通过π电子授受作用结合,促进吸附[52]12。随着生物质热解温度的增大,生物炭的比表面积和孔隙率也随之增大,这就意味着生物炭会产生更多的芳香结构和吸附位点,使孔隙填充机制因阳离子-π/P(π)-π EDA(电子供体-电子受体)相互作用而增强,对皂苷的吸附能力也随之增大[52]13。三萜皂苷的化学结构中存在脂溶性的皂苷元和水溶性的糖链,生物炭的表面官能团能与皂苷极性基团通过静电作用、氢键作用等发生相互作用,与非极性基团通过疏水作用促进吸附[53]。

2.2 生物炭可改善土壤理化性质减少化感物质的分泌

土壤团聚体结构破坏[54]、缓冲能力减弱[55]、酸化加剧[56]、板结、透水性能减弱[57]等是由皂苷积累诱发的连作土壤性能退化标志,也是阻碍连续种植此类药用植物的重要原因。生物炭表面具有大量的孔隙,既可以在小孔隙中截留水分,增强土壤持水能力[58-60];又能在雨后帮助水分通过较大的孔隙从地表渗入,提高土壤水分渗透性[61]。相关研究表明,施加一定量的生物炭可使土壤持水能力提升22%以上[62]。此外,土壤团聚体的形成和稳定对于保持土壤生产力、抑制土壤退化、减少土壤退化造成的环境污染至关重要[63]。有文献指出添加秸秆生物炭后土壤团聚能力普遍提高8%～36%[64]。药用植物连作通常会使土壤酸化加剧[65],而生物炭表面含有带负电荷的羟基、羧基和酚基等,使其普遍呈碱性,从而成为酸性土壤的有效改良剂[66]。此外,生物炭中的碳酸盐、重碳酸盐和硅酸盐可以与土壤-水中的H+结合,提高土壤pH[67]。有研究指出向酸性土壤中施加生物炭,土壤pH能提高0.5～1.0,有机质提升31.05%。因此,生物炭能改善土壤理化性能,适应药用植物如三七喜阴湿的生长习惯,一定程度上缓解其连作障碍。

生物炭本身具有一定潜在养分可被利用,能释放一定量的氮、磷、钾。生物炭在热解过程中能保留原材料中钾元素,并主要以不完全分解的有机质[68],游离盐如KCl、K2SO4[69],生物炭的表面吸附层和结构层[70]3种形式存在。当然,生物炭自身提供的全氮、全磷、全钾不一定能反映植物的实际可利用性。但有研究表明生物炭可通过提高土壤中氮、磷、钾等元素的生物化学循环提升土壤肥力[71-72]。有学者监测了文山州休耕、连作及间作的三七土壤与未植土壤中速效钾的含量,结果显示在三七连作土壤中速效钾含量较未植土壤降低了7%[73]。而向酸性土壤中施加生物炭,土壤中速效钾含量显著提升[74]9。这是因为生物炭能提高土壤中解钾菌(Azotobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)数量和代谢活性,直接将植物难以利用的缓效钾以有效态形式(速效钾)释放出来,实现土壤中钾元素的生物化学循环[75-76]。此外,生物炭已被证明可以改善土壤的结构和肥力[77-78]。生物炭能通过离子交换吸收含有营养物质的溶解性有机质,并通过解吸作用缓释[79]。可见,当生物炭施加到土壤中其自身能提供一定的养分,还可提升营养元素的生物化学循环;又可以防止土壤中营养流失、保持土壤肥力,从而优化植物生境,减少化感物质的分泌。

2.3 生物炭可改善土壤微生态环境

土壤中的微生物能通过调控土壤结构、碳储存能力、营养循环、抵抗病虫害能力等影响土壤功能和植物生长[80]。不仅如此,微生物降解也是减少化感物质的主要途径。皂苷被微生物代谢的主要途径是将皂苷上的糖基逐步水解,生成毒性更小或者无毒性的次级皂苷,最终代谢产物为皂苷元。链球菌(Streptococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)在无氧条件下可以将人参皂苷Rb1和Rb2降解为人参皂苷Rd,经过进一步降解得到化合物Compound-K和20(s)-原人参二醇[81]。

土壤中添加生物炭可增加微生物总量,微生物的群落组成和酶活性也发生显著变化[82-83]。一方面,生物炭具有多孔结构,其碳基属性适合大部分微生物定殖,能为细菌(0.3～3.0 μm)、真菌(2～80 μm)和原生动物(7～30 μm)提供避难场所,使它们免于被微小节肢动物捕食,部分微生物还能利用生物炭独特的物理结构调节自身数量与活性。生物炭的大孔(>200 nm)是细菌生长繁殖的最佳场所,而中孔(2～50 nm)和微孔(<2 nm)可以储存生物炭利用其表面含氧官能团吸附的微生物代谢所需的阴阳离子、水和可溶性物质[84]。不仅如此,生物炭自身就能提供一定的碳源(生物炭中的烷氧碳是定殖微生物的主要碳源)和营养元素,促进微生物繁殖,增强其活性[85]。

由皂苷引发连作障碍土壤中往往是真菌丰度大于细菌丰度的发病土壤,而土壤中细菌数量的提升是土壤健康状况改善的指针[86]。有研究表明,细菌能通过疏水吸引、静电力等方式吸附到生物炭表面,不易在土壤中浸出。而真菌由于其菌丝网络不易移动而不易吸附在生物炭上[87]。有文献指出能定殖在生物炭上的主要微生物均为有益菌,如:链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)、β-变形菌(Betaproteobacteria)、放线动孢菌属(Actinokineospora)、假橄榄属(Pseudolabrys)、土杆菌属(Geobacter)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、康奈斯氏杆菌属(Conexibacter)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)等[74]109。此外,向不同作物(如苹果、棉花、番茄等)连作障碍土壤中施加生物炭,土壤中拟杆菌属(Bacteroides)[88-89]、假单胞菌属[90],[91]36、链霉菌属[91]67,[92]、芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)[93]3的相对丰度分别得到明显提升。其中拟杆菌属被证实是人类肠道中具备降解皂苷能力的微生物类群[9]2,[94]5;假单胞菌属也常被用做有效降解皂苷类物质的功能细菌[48]30;而链霉菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属能分泌可水解皂苷类化合物的葡萄糖苷酶和葡萄糖醛酶[9]9,[94]4。

另外,在一定pH范围内土壤中微生物的丰度及活性与土壤pH呈正比[95]。生物炭可提高土壤pH,影响微生物间信号化合物交换,通过水解破坏细胞-细胞信号分子的稳定性,钝化细菌胞间的实际通讯,从而调节特定土壤微生物活性,改变土壤微生物群落结构[96-97]。值得注意的是,细菌和真菌对pH条件的敏感性不同,当pH上升至7左右时,细菌可能会大量增加,而真菌的总生物量变化不明显[98]。此外,干燥的土壤会使微生物休眠甚至死亡,而生物炭添加后土壤的持水能力有所增强,可促进微生物的水合作用。

除了对微生物的直接影响,生物炭还能通过改变土壤酶的活性间接影响微生物[99]。有研究发现向种植三七、人参等植物的土壤中施加生物炭后,土壤中多酚氧化酶、脲酶、蛋白酶、脱氢酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶等酶的活性均有提升[100-104]。其中,脱氢酶是一种参与微生物氧化磷酸化过程的细胞内酶,能反映土壤中活性微生物量,因此其活性的变化常被作为衡量退化土壤恢复程度的指标[105-106];而β-葡萄糖苷酶不仅与土壤中有机物循环密切相关[107],还被证实具有催化烷基糖苷、芳基糖苷等分子糖链末端非还原性β-D-葡萄糖苷键水解的作用,能将糖基化人参皂苷生物转化为毒性更低甚至无毒性的次级稀有皂苷[108]。除了提升某些土壤酶活性外,生物炭还能吸附固定和失活某些致病酶,如番茄枯萎菌(Fusariumoxysporumf.sp.radicislycopersici)能分泌降解植物细胞壁和解毒代谢产物的酶(果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、角质酶和磷酸酶等)。通过降低这些致病酶与植物根系细胞壁的接触,可减少细胞壁的物理损伤,有效阻碍病原菌的侵染,保护作物免受土壤病原菌的侵害[109]。

2.4 还原性生物炭调控皂苷源连作障碍的优势

研究人员在缓解皂苷源土壤连作的措施研究中发现,对连作土壤进行灌水覆膜处理,土壤在厌氧与好氧、干燥与湿润之间的循环,能显著影响土壤中碳、氮循环,使土壤营养元素的化学形态和生物有效性随之变化,改善土壤微生态环境[110]。灌水覆膜期间营造的厌氧还原环境抑制了病原菌如镰刀菌属的种群数量和相对丰度,增加了芽孢杆菌、链霉菌和拟芽孢杆菌(Bacteroides)有益微生物的丰度[93]3-4,[111]。同时,拜氏梭菌(Clostridiumbeijerikckii)等功能性厌氧微生物能将皂苷作为自身代谢所需的碳源降解,其多样性和丰度都显著增加,土壤条件也更有利于有益微生物的繁殖[112]。然而大部分连作土壤不具有灌水覆膜处理的自然条件。而生物炭可通过一系列改性手段,定向优化其特定性质[23]404,更有针对性地解决皂苷源土壤连作障碍问题。

3 结论与展望

皂苷在土壤中大量积累,不仅会对种植的药用植物产生化感自毒作用,影响种子萌发和产量;还会破坏土壤中微生态环境的平衡,导致病原菌大量富集,从而诱发根腐病、锈腐病等土传病,引发土壤连作障碍。生物炭可以通过以下途径缓解连作障碍,为保护耕地以及药用植物的可持续生产提供方法:(1)直接吸附减少土壤中积累的皂苷;(2)改善土壤理化性质,优化药用植物生存环境从而减少皂苷的分泌;(3)改善土壤微生态环境,富集有益菌群抑制致病菌,提升能降解皂苷的相关功能酶活性等。同时,还原剂改性的生物炭拥有更大的比表面积、更高的孔隙率、更丰富的含氧还原性官能团,对构建还原性的土壤环境有积极作用,可以更有效地缓解皂苷的产生、释放和积累,也更有利于消减土壤中已积累的皂苷。

虽然还原性生物炭在解决皂苷源连作障碍问题中拥有良好的应用前景,但仍有许多问题值得思考:还原性生物炭需要达到多少施用量才能帮助土壤建立还原环境,发挥还原环境的优势,缓解连作障碍;除了优化了自身孔隙率、比表面积、官能团种类和数量外,其特有的还原性能在帮助营造土壤还原环境时是如何减少土壤中病原菌的丰度,又是通过什么机理富集有益微生物;还原性生物炭在土壤环境中的功效可持续时间以及施用后可能产生哪些负面影响。需要综合考虑以上问题从而有针对性地设计和制备还原性生物炭,才能有效修复不同皂苷源以及积累量的连作土壤。