悬移质泥沙-微囊藻毒素复合体对大型溞的毒性效应

2024-03-28冯琴霜重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室重庆400045

中国环境科学 2024年3期

冯琴霜,黄维,何强,李宏(重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400045)

泥沙是水生生态系统中一种重要的环境介质,能为污染物从水相到固相与水体到生物体等多种途径的迁移充当载体.在水库泄水期时,河流沉积物表层轻质细颗粒泥沙在水流裹挟作用下进入水环境,演变成为悬移质泥沙(SPM).相较于其他类型泥沙而言,SPM 具有更大的比表面积,能为水环境中污染物的附着提供更多的吸附位点,进而影响水体中污染物的迁移转化[1].

微囊藻毒素(MCs)是由产毒微囊藻合成并释放到水生环境中的一种有毒物质[2-3].当藻细胞受到胁迫或衰亡而发生破裂时,细胞内的MCs 会进入水生态环境中,并通过皮肤接触或者食物链富集等方式进入水生生物或人体内,从而对水生生物及人体健康造成伤害[4-7].占水体中MCs总浓度46%～99.8%的异构体MC-LR[8]是最普遍、分布最广、毒性最强的一种异构体[9].研究发现,MC-LR 对大型溞的48h 半数效应浓度(EC50)为13.46mg/L[10],且MC-LR 暴露造成大型溞能量损伤,其中7d 龄大型溞毒素生物转化能力更强,而3d 龄大型溞抗氧化应激能力更强[11].

研究表明,水体中超过81%的MCs 可通过吸附作用去除[12-13].而SPM 所具有的粒径小、比表面积大、重量轻等特点使其成为了一种很好的污染物载体.研究发现河流中的泥沙对环境中的有机物具有很强的吸附亲和力,是环境中污染物重要的汇[14],且悬浮颗粒物的大小会影响大型溞的摄食[15].目前鲜有研究评估SPM吸附MC-LR所得到的复合体的生态毒性效应.

本研究通过吸附动力学实验制备了不同MCLR 吸附量的SPM-MC-LR 复合体,并对水生态毒理模式生物大型溞进行24 和48h 的暴露实验,从大型溞的固定率、复合体在大型溞肠道内的累积情况以及抗氧化酶活性的角度,解析复合体对大型溞生理特性的影响,以期为评价环境中SPM-MC-LR 复合体的生态环境风险提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

SPM 均取自于三峡库区长江支流御临河,其d50=6.79µm, d90=35.4µm.MC-LR 标准品和大型溞(Daphnia magna)购自中国科学院水生生物研究所,其中大型溞在恒温光照培养箱中以温度(20±1)℃、光暗时间比16:8 的实验条件下进行培养,并且每天用浓缩斜生栅藻(Scenedesmus obliquus,密度约为5×105cells/mL)进行饲喂.MC-LR 在灭菌水体中几乎不存在降解,在自然水体中降解的半衰期为0.44～22d[16-18].整个实验过程中使用的所有化学药品均为分析纯,所有使用的水均为超纯水.

1.2 SPM 对MC-LR 的吸附

1.2.1 吸附动力学称取 0.04g SPM 于装有100mL 1000µg/L MC-LR 溶液、添加有200mg/L 的NaN3(用于抑制微生物的生长)的遮光锥形瓶中,置于恒温振荡箱中(25℃,150r/min).分别在反应0.5,1,2,4,12,24,36,48,60,72h 时间点取样2mL 并过滤,采用高效液相色谱检测MC-LR 的浓度变化,计算每个时间点的吸附量,拟合吸附动力学曲线,确定MC-LR在SPM 上的吸附平衡时间.

1.2.2 吸附等温线称取0.008g SPM 于MC-LR浓度分别为0,200,400,600,800,1000,1200,1500,1800和2000µg/L 且添加有200mg/L 的NaN3的遮光锥形瓶中,置于恒温振荡箱中(25℃,150r/min)反应36h.过滤后测定滤液MC-LR 浓度,计算每种MC-LR 浓度对应的吸附量,拟合确定最佳吸附等温模型.

1.2.3 SPM-MC-LR 复合体的制备泥沙浓度超过400mg/L 时会对藻类的生长产生抑制作用[19],本研究团队的长期监测数据表明三峡库区支流-御临河泥沙浓度在泄水期可达40～500mg/L.此外全球水体胞外MCs 平均浓度可达230.19µg/L[6].为了探究在环境浓度条件下SPM 吸附MC-LR后的复合体对水生态毒理模式生物大型溞的毒性作用,以初始浓度为160µg/L 的MC-LR 和400mg/L 的SPM 进行复合体的制备.根据SPM 吸附MC-LR 的吸附动力学过程,分别在第 0.5,2,6,12,24,48h 进行取样,经8000r/min 离心10min,取上清液过滤后测定MC-LR浓度,用于计算SPM 上所吸附的MC-LR 的量.将所得的复合体经冷冻干燥后于干燥箱中保存,用于后续毒理实验.

1.3 SPM-MC-LR 复合体对大型溞的暴露实验

将复合体制备的吸附动力学不同时间取样得到的复合体,即分别对应吸附初期(0.5h)、吸附中期(2h)、吸附后期(6h)以及吸附平衡(48h)4 个不同吸附阶段的 SPM-MC-LR(31.51,52.52,73.52 和 94.53µg/g)添加至含有40mL 实验液的100mL 烧杯中,其中SPM 浓度为400mg/L,同时设置不添加SPM 和MC-LR 的空白对照组以及只添加SPM(即MC-LR含量为0µg/g)的处理组,并准确计数放入20 只7d 的大型溞,4 个烧杯为一组,便于实验过程中大型溞存活率的计数,每组实验3 组平行.实验前对大型溞进行6h 饥饿处理,实验期间不喂食,其余实验条件与饲养时一致.在实验过程中,为了让复合体始终保持悬浮状态,每隔5h 用玻璃棒轻轻搅动一次反应液[20].

在实验进行到24 和48h 时,利用光学显微镜和手动计数器对各处理组中的大型溞存活数量进行统计.轻轻摇动烧杯,若受试大型溞在15s 之内不能游动,则认定其为受抑制的个体.统计各个处理组的固定率,并计算相应的EC50.在实验初始以及实验进行到第24,48h 时,从各个处理组中随机选取3 只大型溞,用0.9%的生理盐水洗去表面附着残留的复合体,置于载玻片上于体视显微镜下观察各处理组中大型溞摄食复合体情况.暴露实验结束时,用浮游生物网收集大型溞,同时弃去死亡个体,用除氯自来水将大型溞冲洗1 次,接着用去离子水冲洗1 次,最后用0.9%的生理盐水冲洗2 次,去除大型溞体表泥沙,并在滤纸上晾干,然后转移到2mL 离心管中,于分析天平上称重.经液氮冷冻后将离心管中的大型溞全部转移至玻璃匀浆器中,并以1g: 9mL 的比例添加0.9%的生理盐水,置于0℃冰-水混合水浴中充分研磨.匀浆结束后将匀浆液全部收集至离心管中,并在10000r/min、4℃下离心10min,收集上清液于-80℃冰箱保存直至分析[21].本实验中酶活性测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒,按照说明操作测定各处理组中SOD、CAT、GST 活性和MDA以及组织中总蛋白质含量,最后用总蛋白浓度进行归一化处理.

1.4 数据处理

实验数据使用Excel 软件进行处理,图中数据呈现方式为“平均值±标准偏差”,采用IBM SPSS Statistics 26 对数据进行统计学分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)来检验各组间的显著性差异,当P<0.05 时表明实验样本之间具有显著性差异,并采用Origin 2023 学生版软件对实验数据进行绘图.

2 结果与分析

2.1 SPM 对MC-LR 的吸附模型拟合

2.1.1 吸附动力学如图1(a)和表1 所示,在反应初期的0～4h 内,SPM 上MC-LR 吸附量增加得较为迅速,随后吸附量增加速率逐渐放缓,并在开始反应后的第36h 达到吸附平衡.

表1 SPM 吸附MC-LR 动力学模型拟合参数Table 1 Parameters of kinetic adsorption model for MC-LR adsorption by SPM

表2 SPM 吸附MC-LR 等温吸附模型拟合参数Table 2 Parameters of isothermal adsorption model for MC-LR adsorption by SPM

图1 SPM 吸附MC-LR 的动力学模型拟合和等温模型拟合Fig.1 Fitting of kinetic model and isothermal model for MC-LR adsorption by SPM

拟一级和拟二级动力学模型拟合的R2均大于0.95,说明这2 种模型都能很好地拟合该吸附动力学过程.SPM 吸附MC-LR 更符合拟二级动力学模型,即该吸附过程是多个吸附阶段共同作用的结果[22],拟合的最大饱和吸附量为1583µg/g,也更接近实验测定值.这表明MC-LR 主要是通过如络合作用、氢键作用、共用电子对等化学作用力吸附在SPM 上[23].该结果与Maghsoudi 等[14]和Liu 等[24]进行的沉积物、泥沙吸附MCs 的吸附动力学过程拟合结果一致.

2.1.2 吸附等温线如图 1(b)和表 2 所示,Langmuir、Freundlich、Temkin 这3 个模型拟合的相关系数(R2)均大于0.95,表明这3 种模型都能很好地拟合SPM 吸附MC-LR 的过程.Freundlich 模型拟合参数的相关系数(R2)略大于其他2 种模型,这表明MC-LR 在SPM 上的吸附过程更符合Freundlich 模型,也就是说SPM 吸附MC-LR 是一种以化学吸附为主导的多分子层吸附过程,该研究结果与Mohamed 等[25]进行的沉积物吸附MCs 的实验结果一致.且1/n 介于0～1 之间,表明MC-LR 在SPM 上的吸附较为容易进行.通过Langmuir 等温吸附参数可知,该过程中SPM 对MC-LR 的最大吸附量可达1720µg/g.

2.2 大型溞固定率的响应

毒理实验中,固定率是最直观地反映测定物浓度影响被试生物的指标.如图2 所示,在暴露实验期间,空白对照组中大型溞48h 固定率为4%,小于5%,表明利用本批次大型溞所进行的暴露实验的实验结果是合理的[26].同时,在SPM组中,经过24h暴露后,大型溞的固定率为8.44%,略高于空白对照组,这表明SPM 可能对大型溞存在轻微毒性或者通过影响大型溞的活动使大型溞被固定.当暴露实验进行

暴露24h 时,MC-LR 剂量为31.51,52.52,73.52和94.53µg/g 的4 个处理组中大型溞的抑制率均存在显著差异(P<0.05),且抑制率随着复合体上MC-LR 含量的增加而增加;当暴露实验进行到第48h 时,MC-LR 剂量为31.51,52.52µg/g 的2 个处理组中大型溞固定率差异更加明显,但MC-LR 剂量为73.52 和94.53µg/g 的2 个处理组中大型溞固定率差异不显著(P>0.05),分别为84.44%和93.77%.在这2个MC-LR 剂量浓度下,几乎所有大型溞的活动都受到了抑制,甚至已经严重影响到大型溞的生理机能.此外,大型溞的24 和48h 的EC50分别为94.06 和44.37µg/g.

2.3 大型溞体内SPM-MC-LR 复合体的生物累积

如图3 所示,空白对照组中,实验开始时经过饥饿处理后的大型溞肠道内仅有少量栅藻残留,暴露实验结束时,仅在肠道末端有少量未排出的残留物.在MC-LR 剂量为0 和31.51µg/g 的2 个处理组中,经过24 和48h 的暴露后,大型溞的肠道内充满了复合体颗粒物且分布较为均匀,这可能与大型溞的肠道蠕动有关,在经过48h 暴露实验处理的大型溞的触角上还附有少量复合体颗粒物.而在MC-LR 剂量为52.52,73.52,94.53µg/g 的3 个较高剂量处理组中,经过24h 暴露实验处理过后的大型溞肠道内也均匀布满复合体颗粒物,且其触角上没有出现明显的复合体颗粒物附着;但在经过48h 暴露实验处理后,大型溞体表及触角上颗粒附着物明显增多,且在MC-LR 剂量为73.52 和94.53µg/g 的2 个高剂量处理组中的大型溞肠道内还出现了复合体颗粒物在前段肠阻塞现象,这可能是因为高浓度复合体颗粒物使大型溞生理活性受到抑制,大型溞肠道蠕动频率降低,无法将复合体颗粒物排出体外.

图3 初始,24 和48h 后不同处理组中SPM-MC-LR 复合体颗粒物在大型溞肠道累积情况Fig.3 Accumulation of complex particulate matter of SPMMC-LR in the intestines of Daphnia magna after 0, 24 and 48h exposure in different treatment groups

2.4 大型溞体内酶活性的响应

当大型溞暴露在不同剂量的复合体颗粒物当中时,可能会破坏大型溞体内的生物氧化剂与抗氧化剂比例的平衡,导致活性氧(ROS)水平升高,从而对细胞造成损伤[27].丙二醛(MDA)是脂质过氧化的最终产物,是评价自由基引起严重氧化应激导致细胞膜损伤的指标.由于氧化应激是对应激因素的第一反应,细胞最初启动抗氧化防御和解毒过程.超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)在抗氧化防御系统调节氧化应激过程中起着至关重要的作用,谷胱甘肽转移酶(GST)主要参与细胞解毒过程.

MDA 是生物体发生脂质氧化的终产物,通过测定生物体内MDA 的含量,可反映出生物体脂质氧化的程度,从而间接反映生物体内细胞损伤的程度[28].由图4(a)可知,与对照组相比,在经过24h 暴露处理后,MC-LR 剂量为0µg/g 处理组中MDA 含量稍高于空白对照组,且存在显著差异(P<0.05);但在经过48h暴露处理后,0µg/g处理组中MDA含量明显低于对照组,说明大型溞吞食SPM 颗粒能够稍微减缓由于饥饿而产生的氧化损伤.同时,在经过48h 暴露处理后,5 个处理组中的MDA 含量呈正向剂量依赖,且各处理组中MDA 含量存在显著差异(P<0.05).

CAT 的主要功能是将H2O2转化为H2O 和O2以减少其对机体的伤害;一般情况下,发生氧化应激时,生物体内的SOD 和CAT 的变化趋势同步[29].如图4(c)所示,在经过24 和48h 暴露处理后,各个处理组中CAT 活性变化趋势与SOD 完全一致,且酶活性变化均与复合体颗粒物上MC-LR 的剂量呈正相关,这表明生物体内发生氧化应激时,可通过SOD 和CAT 的共同作用来减少机体内活性氧自由基对于机体的氧化损伤程度.在MC-LR 剂量为73.52 和94.53µg/g 这2 个高剂量处理组中,经过48h 暴露处理后的SOD 和CAT 活性相较于24h 时均有降低(SOD 和CAT 分别降低了17.66%、20.96%和5.84%、15.45%),这可能是大型溞体内的活性氧自由基过高,造成部分细胞直接失活,从而导致大型溞抵抗氧化应激的能力减弱.Cui等[30]将大型溞急性暴露于农药氟苯二胺中,也观察到类似的抗氧化酶活性变化.

GST 是一种多功能酶,其主要作用是代谢脂质过氧化物以及参与催化谷胱甘肽(GSH)与异种生物和细胞毒醛的结合,能够将MC-LR 转化为具有更强水溶性以及更好排泄的谷胱甘肽络合物(GSH).有研究证实GST 活性随暴露污染物浓度的增加而升高[11,31-32].如图4(d)所示,在经过24h 暴露处理后,各处理组中的GST 活性相较于对照组均有不同程度的升高(分别增加了0.8029 倍、1.634 倍、3.251 倍、5.432 倍和5.887 倍)并存在显著差异(P<0.05),且GST 活性随着复合体颗粒物上MC-LR 剂量的增加而升高.经过48h 暴露处理后,各处理组中的GST 活性较对照组仍有不同程度的增加,并且依旧呈现出正向剂量依赖性,但在MC-LR 剂量为73.52 和94.53µg/g 的2 个处理组中GST 活性不存在显著差异(P>0.05).综合来看,GST 活性呈剂量和时间依赖性增加.

3 讨论

3.1 SPM-MC-LR 复合体对大型溞的固定率呈正向剂量和时间依赖性

比较各处理组中24h 和48h 大型溞的固定率可以发现,在MC-LR 剂量为52.52,73.52,94.53µg/g 这3个处理组中,相较于24h大型溞的固定率,48h时大型溞的固定率增加幅度较大,分别增加了1.56 倍、1.09倍和0.79 倍,且24h 的EC50相比于48h 增加了1.12倍,这表明高浓度复合体颗粒物对大型溞的毒性作用不仅表现出正向剂量依赖性,同时还表现出正向时间依赖性(图5 路径④).

大型溞作为一种非选择性滤食性浮游动物,可以无选择性地摄取小于70µm的小颗粒物质[33],本研究所用SPM 几乎都能通过大型溞摄食行为进入到肠道内.SPM 所具有的小粒径、高比表面积等特性为MC-LR 的吸附提供了充足的吸附位点,MC-LR以吸附在SPM 上的方式进入大型溞的肠道内,并能在大型溞体内消化液的作用下被解吸出来,相较于MC-LR 溶液,经颗粒物负载后MC-LR 在大型溞体内的生物累积明显增加[34-35];其他研究也表明,当纳米二氧化钛颗粒存在时,镉等重金属在金鱼和大型溞体内的生物累积量明显增加[36-37].高剂量复合体颗粒物上所吸附的MC-LR 量更大,解吸出来的MC-LR 对大型溞产生的生物毒性也更强.因此,在梯度剂量复合体颗粒物暴露实验结束时,其对大型溞的固定率呈现正向的剂量、时间依赖性.值得注意的是,MC-LR 剂量为94.53µg/g 处理组(若MC-LR全部解吸,体系中MC-LR 的浓度可达37.81µg/L)中,大型溞48h 固定率高达93.77%,与Wan 等[10]的研究中25mg/L MC-LR 单独暴露对应的固定率相近,而且该研究中48h的EC50(13.46mg/L)远远高于本研究(若全部解吸,体系中MC-LR 浓度为17.75µg/L),表明SPM 可以大幅度增强MC-LR 对大型溞的毒性.类似的研究指出悬浮颗粒物存在时,同一浓度下菲对大型溞的固定率可以提高1.6～2.7 倍[35].

3.2 SPM-MC-LR 复合体影响大型溞的游泳行为和肠道蠕动功能

微纳米塑料可通过静电相互作用等粘附于大型溞体表和触角上,从而导致大型溞被固定下来甚至造成物理损伤[38-39].本研究中也发现,复合体颗粒物会在大型溞的体表和第二触角上粘附(图3),第二触角是大型溞运动的重要器官,运动受阻也可能是大型溞被固定的原因之一.从复合体颗粒物中解吸出来的MC-LR 对大型溞所产生的神经毒性也会使得其游动速度大大降低,从而更有利于颗粒物在触角上的附着,进而对大型溞的游泳行为产生负面影响,最终对其生存造成威胁[40-41].

研究表明,微纳米颗粒容易在大型溞的胸足部和消化道内累积[38,42],严重时还可能出现肠道阻塞现象[43].本实验中MC-LR 剂量为52.52,73.52 和94.53 µg/g 的3 个高剂量处理组中,暴露实验结束时,出现了复合体颗粒物在大型溞肠道前端堆积的现象,这可能是因为复合体颗粒物上解吸出来的MC-LR 所产生的毒性作用使得大型溞肠道蠕动功能减弱甚至丧失,大型溞不能通过肠道蠕动将复合体排出体外,反向增加了复合体颗粒物在肠道内的解吸时间,从而加重了复合体颗粒物对大型溞的毒性作用(图3).当大型溞摄食微塑料后,规则的微塑料比不规则的微塑料更容易排出体外,对大型溞的毒性作用也更弱[44].SPM 不规则的形状也增加了复合体颗粒物在肠道内的接触时间.但在微纳米塑料对大型溞的暴露实验中,大型溞所表现的一切现象均是因微纳米塑料对大型溞产生了毒性作用.在本研究当中,SPM 对大型溞几乎没有毒性作用,仅作为一种污染物载体;但吸附在SPM 上的MC-LR 通过大型溞摄食SPM 而进入其肠道内,在消化液的作用下解吸出来,从而对大型溞产生毒性作用.

3.3 大型溞在SPM-MC-LR 复合体作用下产生氧化应激

当大型溞体内出现胁迫引起氧化应激时,体内的抗氧化系统可通过调节抗氧化酶活性来维持机体的正常运转.MDA 含量的上升表明大型溞体内出现的氧化应激程度已经超出了抗氧化酶调节的阈值,从而导致大型溞体内细胞出现脂质过氧化(图5路径①)[45],这可能会导致大型溞的死亡(图4(a)).

SOD-CAT 系统是机体发生氧化应激时抗氧化系统的第一道防线,SOD-CAT 这2 种酶活性增加能够有效清除氧化应激过程中产生的和H2O2等活性氧自由基,从而减轻其对机体的氧化损伤[34].因此,在经过24 和48h 的梯度剂量复合体颗粒物暴露处理后,各处理组中的SOD 和CAT 酶活性均有不同程度的升高(图4(b)和(c)),表明大型溞摄食复合体颗粒物后,导致体内出现氧化应激.但在MC-LR 剂量为73.52 和94.53 µg/g 的2 个处理组中,48h 暴露结束后,大型溞体内的SOD 和CAT 酶活性较24h 分别降低了21.44%、26.51%和6.2%、18.27%,结合图2各组中固定率的变化情况来看,这2 个处理组中的大型溞可能出现了氧化应激的程度过高的现象,导致SOD 和CAT 抗氧化酶的活性被抑制(图5 路径②)[46].对照组中SOD 和CAT 活性升高可能是由饥饿引起的ROS 活性上升,Bu 等[47]已经证实了短期禁食会使得鱼体内的ROS 和MDA 含量明显增加.暴露结束时,0 µg/g 处理组中SOD 和CAT 酶活性稍有降低,表明吞食SPM 颗粒能够为大型溞的生存提供一定的营养物质,这在一定程度上减轻饥饿带来的氧化损伤(图4(b)和(c)).Zhang 等[48]的研究证实了这一点,该研究将大型溞暴露在含400mg/L 的天然悬浮颗粒物(d50=38.42 µm)溶液中,即使7d 不喂食,大型溞仍旧十分活跃,即悬浮颗粒物可能能为大型溞的生存提供必要的营养物质.

GST 是抗氧化系统的第二道防线,主要负责MC-LR 的生物转化以及脂质过氧化物的代谢[11,49],GST 活性的升高则表明机体内发生的氧化应激靠第一道防线已经不能调节[34].在经过24 和48h 暴露处理后,5 个梯度剂量复合体颗粒物处理组中,GST活性变化呈正向剂量和时间依赖(图4(d)).Ortiz 等[11]研究发现,当MC-LR 浓度(>50µg/L)过高时,大型溞体内的GST 活性会降低,即大型溞对MC-LR 的解毒功能会受到抑制.本研究中GST 活性并没有下降,表明从复合体颗粒物中解吸出来的MC-LR 还没有达到抑制大型溞生物解毒能力的浓度(图5 路径③).同时,GST 活性呈现出的正向剂量、时间依赖性也表明在暴露实验的整个过程中,所产生的氧化应激的调节都必须靠两道防线的共同作用.此外,研究表明7d 龄大型溞经过10µg/L MC-LR 的48h 暴露后,GST活性相较于对照组增加不到1 倍[11],低于本研究中MC-LR 剂量为31.51µg/g 处理组(若MC-LR 全部解吸,体系中MC-LR 的浓度可达12.60µg/L)的GST 活性增量(1.5 倍),表明SPM-MC-LR 复合体的毒性强于游离的MC-LR.

本研究中,由MC-LR 在大型溞体内所引起的氧化应激、毒性作用和颗粒物附着在体表及触角上对于大型溞行动限制的共同作用使得大型溞被固定下来(图5 路径⑤).但在SPM 浓度一致的条件下,综合5 个梯度剂量复合体颗粒物处理中大型溞的固定率来看,从复合体颗粒物中解吸出来的MC-LR 诱导发生的氧化应激和产生的毒性作用才是导致高固定率出现的主因(图5).