环洞庭湖土壤抗生素抗性基因分布和潜在风险

武 晨,黄凤莲,刘新刚,范青青,陆海楠,李启武,郭 倩,李 莹,彭勇春,李 峰*(1.湘潭大学环境与资源学院,湖南 湘潭 41110；2.长沙环境保护职业技术学院,湖南 长沙 410004；.国家环境保护城市土壤污染控制与修复工程技术中心,上海市环境科学研究院,上海 2002；4.环境生态健康湖南省普通高校重点实验室,湖南 湘潭 41110；.湖南省长沙生态环境监测中心,湖南 长沙 410001；.湖南省生态环境监测中心,湖南 长沙 41002；.湖南省湘西生态环境监测中心,湖南 吉首 41000；8.国家环境保护重金属污染监测重点实验室,湖南 长沙 410014)

洞庭湖流域是湖南省乃至全国最重要的商品粮油基地和水产养殖基地之一,同时也是长江流域重要的绿色生态屏障,对维护当地生物多样性和生态健康安全具有重要作用.然而,由于工业生产和农业面源污染等原因导致环洞庭湖流域周边环境受到不同程度的污染.以往研究大多关注洞庭湖流域水体、沉积物和周边土壤中重金属、多环芳烃和农药等传统污染物的赋存特征、来源和环境风险[1-2],忽略了抗生素抗性基因(ARGs)在环洞庭湖流域周边环境的丰度分布和潜在风险.ARGs 作为一种新污染物被广泛的从生态系统中检出,ARGs 能够在不同细菌种群之间发生基因水平转移并且存在自身扩增的独特行为从而引起生物体高耐药性,对农业生物安全、生态环境健康和全球公共卫生安全造成潜在威胁[3].

土壤是环境中ARGs 重要的“汇”,也是ARGs向水体和大气等环境介质发生迁移转化重要的“源”[4].污泥农用和有机肥施用等活动向土壤中引入病原菌和耐药菌从而增加土壤ARGs 丰度和多样性,并进一步促进可移动基因元件(MGEs)在土壤-植物系统中的传播,从而对土壤生态系统造成危害[5].重要的是,土壤ARGs 能够通过多种暴露途径进入人体微生物组和病原体中,将增加人体耐药性从而使疾病治疗难度增加,对人体健康造成严重影响[6-7].因此,亟需评估环洞庭湖流域周边土壤中ARGs 的潜在健康风险.

由于缺乏ARGs 的剂量-效应模型,导致准确评估ARGs 对人体造成的健康风险存在一定难度[8].已有学者尝试采用定量微生物风险评估、实验室筛选致病菌和流行病学调查等方式搭建ARGs 健康风险评估框架,以评估人体对ARGs 的摄入量,从而筛选高风险ARGs[9-13].值得注意的是,现有的评价方法多依赖某些确定性参数(如土壤颗粒吸入速率、暴露时间和体重等),但由于环境中ARGs 丰度的不确定性和特定人群受体的变化,易引发对潜在暴露剂量和健康风险的高估或低估[14].Monte Carlo 模拟已被广泛的应用于污染物的概率健康风险评估中,该方法可以准确评估健康风险超过阈值的概率并确定优先控制因子[15].

因此,本研究通过实时荧光定量PCR(qPCR)对环洞庭湖流域表层土壤中不同类型的ARGs 丰度进行系统分析,明确研究区域土壤中ARGs 分布特征,采用Monte Carlo 模拟评估土壤ARGs 多途径暴露下的人体暴露剂量和潜在健康风险,以期为环洞庭湖流域周边表层土壤中ARGs 风险管控提供科学依据,为农业系统可持续发展和维持生态环境安全提供科学支撑.

1 材料与方法

1.1 点位布设和样品采集

本研究在环洞庭湖流域共设置表层土壤采样点位52 个(图1),其中东洞庭湖流域采集19 个样本,南洞庭湖流域采集18 个样本,西洞庭湖流域采集15个样本.采用五点取样法采集表层土壤样本.样品放入含有冰袋的保温箱中立即运回实验室置于-80℃保存.土壤样本去除根茎、石块等异物,经过真空冷冻干燥后用灭菌的玛瑙研钵研磨,然后过100 目筛放置在棕色无菌玻璃瓶中,储存于-80℃备用.

1.2 土壤DNA 提取与qPCR

准确称取0.2g 土壤样本,根据Ezup 柱式土壤DNA 抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司,中国)中的操作步骤提取土壤样本中微生物总DNA,然后采用1%琼脂糖凝胶电泳(Thermo Fisher Scientific,美国)和ND5000 超微量紫外分光光度计(北京百泰克生物技术有限公司,中国)检验DNA 浓度和质量.

本研究选取土壤环境中广泛检出的 8 种ARGs 类型和16 种ARGs 亚型作为目标ARGs,选择I 型整合子(intl1)作为MGEs 代表(表1),采用qPCR(LightCycler 96, Hoffmann-La Roche,瑞士)定量分析ARGs 和intl1 在研究区域表层土壤样本中的丰度,每组测试设有3 个平行.qPCR 反应体系为20µL,包括正、反引物各0.5µL(生工生物工程(上海)股份有限公司,中国),SYBR Green Master Mix 10µL(翌圣生物科技(上海)股份有限公司,中国),ddH2O 8.0µL(生工生物工程(上海)股份有限公司,中国),模板DNA 1.0µL.qPCR 反应程序为95℃预变性5min,1 个循环,95℃变性10s、退火温度下退火20s、72℃延伸20s,40 个循环[16].引物信息和退火温度见表1.

表1 qPCR 反应中定量ARGs 和intl1 丰度的引物序列Table 1 Primer pairs for the quantification of ARGs and intl1by qPCR

1.3 土壤ARGs 日均暴露剂量评估

根据《环境污染物人群暴露评估技术指南》(HJ 875-2017),分别评估了儿童和成人经不同途径摄取土壤中ARGs 的日均暴露剂量,即经皮肤接触土壤ARGs、经呼吸道吸入携带ARGs 的土壤颗粒和无意中经口摄入携带ARGs 的土壤颗粒,计算公式见公式(1)～(3).为了减小模型中参数的不确定性导致评估结果偏大或偏小的问题,利用Oracle Crystal Ball v11.1.2.4 软件(Oracle,美国)进行了Monte Carlo模拟,设定在95%置信水平上随机模拟迭代次数为10000 次.

式中:ADD 为ARGs 的日均暴露剂量copies/(g·d);C 为ARGs 在土壤中的丰度,copies/g.公式中的其他参数含义及其在Monte Carlo 模型中的输入值见表2.

表2 Monte Carlo 评估土壤ARGs 日均暴露剂量的参数Table 2 Parameter values of the model for daily exposure dose of ARGs in soil with the Monte Carlo simulator

偏远地区具有人口稀少、工业活动极少、环境温度低的特点(如永久冻土、极地和高海拔区域等),这些地区土壤中 ARGs 被认为是原始存在的,ARGs 丰度受到人为因素影响较小[17-18].因此,本研究将青藏高原地区土壤中ARGs 绝对丰度作为土壤中ARGs 丰度背景值(丰度范围是1.80×105～1.35×107copies/g,平均值为 3.03×106copies/g)[19],利用公式(1)～(3)计算的日均暴露剂量作为土壤ARGs 暴露剂量风险背景值,从而判断研究区域土壤中ARGs 的潜在健康风险.土壤ARGs 暴露剂量风险背景值为:成人 12.56copies/(g·d),儿童38.11copies/(g·d).

1.4 数据处理与分析

利用ArcGIS 10.5 绘制土壤采样点位分布图.利用SPSS Statistics 26.0 进行单因素方差分析(Duncan检验)比较不同类型ARGs 的丰度差异,并分析不同地区表层土壤中intl1 的丰度差异(P<0.05).利用SPSS Statistics 26.0 进行Spearman 相关性分析.利用Origin 2017 进行数据可视化.

2 结果与讨论

2.1 环洞庭湖流域周边表层土壤ARGs 分布特征

采用 qPCR 对洞庭湖流域周边表层土壤中ARGs的丰度进行定量.如图2所示,环洞庭湖流域周边表层土壤中ARGs 总丰度范围为3.29×107～3.73×109copies/g.东洞庭湖流域表层土壤采样点中ARGs的总丰度范围为5.36×107～1.97×108copies/g,西洞庭湖流域表层土壤中ARGs 的总丰度范围为5.75×107～7.34×108copies/g,南洞庭湖流域表层土壤中ARGs 的总丰度范围为3.29×107～3.73×109copies/g.研究区域表层土壤中ARGs 丰度远远高于人迹罕至的青藏高原地区土壤中ARGs 丰度(1.80×105～1.35×107copies/g)[19],表明环洞庭湖流域表层土壤受到了人类活动的影响造成高丰度ARGs 的积累.三个区域土壤中ARGs 的平均丰度排序为:南洞庭湖流域>西洞庭湖流域>东洞庭湖流域.已有研究表明洞庭湖流域中部地区的化肥使用量及面源污染的环境风险高于东部和西部地区[22].南洞庭湖流域处于研究区域中下游地区,大面积的水流运动导致携带ARGs 的微生物或者病原菌进入下游水体和表层土壤中,从而使该地区土壤中ARGs 丰度较高.此外,本研究中南洞庭湖流域的采样点位靠近工业区,工业废弃物和工业废水中含有的大量的抗生素进入土壤中也会促进更多耐药微生物的产生,并且工业污染排放的污染物在土壤中积累也会影响ARGs 的传播与富集[23].

图2 研究区域表层土壤中ARGs 和intl1 的丰度Fig.2 The abundance of ARGs and intl1in surface soil of the study area

所有采样点表层土壤中均检测到较高丰度的磺胺类抗性基因sul1 和dfrA14、氨基糖苷类抗性基因kan 和喹诺酮类抗性基因qnrB(图2(a)).与其他类型的ARGs 相比,洞庭湖流域周边表层土壤中磺胺类ARGs 丰度最高(P<0.05),其次是氨基糖苷类和四环素类ARGs,表明这3 类ARGs 存在较高的环境风险和潜在的人群暴露风险(图2(b)-(d)).已有研究表明磺胺类和四环素类抗生素在养殖业中广泛使用且在禽畜体内不能被完全降解,从而造成洞庭湖水体以及沉积物中检测到高丰度的磺胺类和四环素类抗生素[24-25].这些抗生素伴随着灌溉水或者施肥进入周边土壤中,加之地表径流和土-水交换等过程,诱导土壤微生物产生高丰度的磺胺类和四环素类ARGs,进一步引起ARGs 在蔬菜、稻米和土壤等介质中的积累[26].sul1 和drfA14 基因是磺胺类ARGs丰度的主要贡献因子(图2(a)),其中sul1 基因在农田土壤[27]、麦田土壤[28]和堆肥土壤[29]中被检到且属于高丰度ARGs 基因.sul1 基因常位于可传播型多抗性的大型质粒或小型非结合质粒上,可通过结合、转导等方式在不同细菌间转移和传播从而导致磺胺类ARGs 在环境中广泛存在[30].然而,一些低丰度的磺胺类ARGs(如drfA10 基因)也被检出,说明ARGs 的丰度不仅受到环境中残留抗生素的影响,还与该基因在环境介质中的稳定性有关[31].值得注意的是,本研究中检测的氨基糖苷类ARGs 类型仅一种(kan 基因),但其丰度较高,这表明kan 基因广泛的存在于研究区域土壤环境中并存在潜在风险.

2.2 intl1 促进环洞庭湖周边表层土壤中ARGs 的传播

由于土壤中intl1 丰度与ARGs 丰度和重金属等抗性基因丰度相关且常存在于致病菌中,所以intl1 被认为是人为污染的环境指示因子且促进ARGs 的传播[32].洞庭湖周边表层土壤中 intl1 的平均丰度为6.94×108copies/g,高于ARGs 平均丰度(图2(e)).洞庭湖流域属于亚热带湿润气候,适宜的温度和湿度促进了土壤环境中细菌的繁殖,而在高浓度的抗生素诱导下导致部分细菌产生intl1[33].此外,高丰度的intl1 可以通过遗传和复制等方式进入后代细菌基因组,利用编码酶来剪切自身与宿主细菌的DNA连接,随即intl1进入细菌的转座酶系统将复制的基因序列插入到细菌的染色体中,从而加速intl1 在不同细菌种群中的传播[34].同时,intl1 与同一基因位点上多个ARGs 的整合密切相关,能够促进ARGs 的水平基因转移过程[35].

通过对各个研究区域采样点intl1与ARGs相对丰度进行相关性分析,探究intl1 对ARGs 扩散传播的影响(图3).结果表明,intl1 与研究区域土壤中高丰度ARGs 基因(如dfrA14、tetR 和kan)的相对丰度均呈显著正相关(P<0.05),表明intl1可以通过水平基因转移的方式介导洞庭湖流域表层土壤中磺胺类(dfrA14)、四环素类(tetR)和氨基糖苷类(kan)ARGs的扩散传播,这也是研究区域这3 类ARGs 丰度较高的原因之一.此外,在南洞庭湖流域和西洞庭湖流域,intl1 的丰度与万古霉素类(vanG)和喹诺酮类(qnrB)ARGs 丰度显著正相关(P<0.05),表明intl1 同步介导了vanG 和 qnrB 的基因水平转移,从而导致这两个区域具有较高的ARGs 丰度.同时,研究区域表层土壤中丰度最高的磺胺类ARGs(sul1)丰度与大环内酯类(ermB)和喹诺酮类(qnrB 和oqxA)ARGs丰度呈显著正相关(P<0.05),表明大环内酯类和喹诺酮类ARGs 与sul1 在南洞庭湖流域和西洞庭湖流域中可能具有相同的来源.

图3 不同类型ARGs 和intl1 丰度的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of abundance of different types of ARGs and intl1

2.3 环洞庭湖周边表层土壤中ARGs 的潜在健康风险

利用Monte Carlo 模型计算了研究区成人和儿童经过消化道暴露、呼吸道暴露和皮肤接触3种途径摄入土壤中ARGs 的日均暴露剂量.由图4可知,人群在环洞庭湖流域不同区域土壤摄入的ARGs 平均剂量排序为:南洞庭湖流域>西洞庭湖流域>东洞庭湖流域,这与ARGs 丰度的区域分布相一致.儿童摄入土壤ARGs 的暴露剂量大于成人,这是由于ARGs 日均暴露剂量与受试人群的体重和暴露时间成反比,而儿童的体重和平均年龄均小于成人.

由于现有研究缺少ARGs 对人体的潜在致癌风险和非致癌风险相应的斜率因子及参考剂量系数,所以本研究将青藏高原土壤(高海拔、温度低且受到人类活动影响小)中ARGs 丰度作为土壤背景值,并由此计算的人体ARGs 日均暴露剂量作为风险背景值(成人为 12.56copies/(g·d),儿童为 38.11copies/(g·d)).如图4 所示,研究区域存在64.92%～98.68%概率的ARGs 潜在健康风险,儿童与成人受到ARGs 潜在健康风险概率相差不大,表明研究区域土壤ARGs造成的潜在健康风险不可忽视.

2.4 不同暴露途径和不同类型ARGs 对人体暴露剂量的贡献

研究区土壤中ARGs 经过3 种暴露途径和8 种不同类型ARGs 对总暴露剂量的贡献比如表3 所示.皮肤接触途径是ARGs 暴露剂量的主要来源,其对成人和儿童暴露剂量的贡献分别达到89%以上和58%以上.成人接触土壤时具有较大的皮肤接触面积,也就导致了较高的皮肤接触的ARGs 暴露剂量.然而,儿童经过消化道途径摄入ARGs 的暴露剂量占比在41%以上,这可能是由于儿童在户外活动时存在频繁接触土壤并吮吸手指的行为[36],从而导致其可能通过消化道途径较高摄入ARGs.因此,需要格外注意儿童在户外活动的卫生防护.

表3 不同暴露途径和不同ARGs 类型对ARGs 日均暴露剂量的贡献比(%)Table 3 Contribution of different exposure pathways and different ARGs types to the daily exposure dose of ARGs(%)

磺胺类ARGs 是总暴露剂量的主要来源,贡献比为47.83%～78.68%,磷酸乙醇胺转移酶和万古霉素类ARGs 的暴露剂量较低,贡献比在1%以下.不同的是,在东洞庭湖流域和南洞庭湖流域中氨基糖苷类和四环素类ARGs 对人群暴露剂量的贡献仅次于磺胺类ARGs,然而在西洞庭湖流域样本中是大环内酯类和喹诺酮类ARGs 的贡献次于磺胺类ARGs.这与不同类型的ARGs 在环洞庭湖流域不同区域土壤中的分布和丰度相关.此外,本研究中磺胺类ARGs亚型(sul1, dfrA14 和dfrA10)的检测数量低于四环素类ARGs 亚型(tetA, tetM, tetX, tetQ 和tetR),但磺胺类ARGs 的丰度及人群暴露剂量远远高于四环素类ARGs,可能是由于人为活动和基因水平转移导致了土壤中磺胺类ARGs 的丰度增加,从而造成较高的潜在健康风险.

3 结论

3.1 环洞庭湖流域周边表层土壤受到人类活动影响导致存在较高丰度的ARGs 和I 型整合子基因(intl1),主要ARGs 类型是磺胺类、四环素类和氨基糖苷类ARGs,平均丰度分别为1.51×108、1.50×107和2.64×107copies/g,主要ARGs亚型是sul1和dfrA14基因.南洞庭湖流域土壤中ARGs 丰度分别是东、西洞庭湖流域土壤中ARGs丰度的3.6倍和2.0倍.intl1基因丰度与不同类型的ARGs 丰度呈正相关,提示intl1 通过水平基因转移促进了研究区域表层土壤中ARGs 的扩散传播.

3.2 环洞庭湖流域周边表层土壤 ARGs 存在64.92%～98.68%概率的ARGs 人体暴露剂量高于风险背景值,表明ARGs 导致的潜在人体健康风险不可忽视,其中皮肤接触途径是土壤ARGs 主要暴露途径,占比为58.42%～90.23%,土壤中磺胺类ARGs是导致潜在健康风险的主要来源,占比为47.83%～78.68%.