血红素加氧酶-1通过诱导抗病毒蛋白的表达增强IFN-α抗HBV效应

笪 蔚,王 琴,魏安邦,张 浩, 汪任冰,刘 倩,周 强

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是DNA病毒科中一种嗜肝的、带包膜的、部分双链的 DNA病毒[1]。HBV感染是一个重要的全球性健康问题,据世卫组织估计,全球有2.57亿人长期感染HBV,每年约有88.7万人死于与HBV相关的并发症[2]。血红素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)是血红素降解的关键酶,打开血红素的卟啉环,并释放等摩尔量的游离铁、绿胆素(biliverdin, BV)和一氧化碳(carbon dioxide, CO)。HO-1是一种重要的应激反应蛋白,它具有抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用,在生理和病理条件下均对机体起保护作用,也被认为是一种细胞保护酶[3];在过去的10年中,HO-1已被成功探索出对多种病毒的抗病毒作用,并且对包膜病毒有选择性,能引起病毒包膜的破坏和解离;如HIV、HCV、HBV、流感、登革热、埃博拉、呼吸道合胞病毒、人类单纯疱疹病毒等[4];被认为是包膜病毒的通用杀病毒剂。在HBV感染中,Protzer et al[5]证明了HO-1可以通过降低HBV核心蛋白的稳定性,直接抑制HBV在肝细胞中的复制,从而抑制HBV核心共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的产生,可见HO-1的诱导可能是治疗乙型肝炎相关炎症的新选择,需要进一步研究其抗病毒机制,该研究旨在探究HO-1能否联合现有的抗HBV药物IFN-α来发挥更强的抗病毒作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂HepG2、HepG2.2.15购自上海富源生物公司;HBV 1.3由安徽医科大学第二附属医院检验科留存;si-HO-1质粒、TRIzol、引物序列购自上海生工生物公司;DMEM、PBS购自上海培源生物科技公司;胎牛血清购自南京维森特生物技术有限公司;0.25%胰酶消化液、CCK-8试剂、双抗、RIPA 裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物有限公司;磷酸酶抑制剂购自上海陶术生物科技;HO-1抗体、MxA抗体购自英国 Abcam公司;p-IRF-3、IRF-3抗体、抗IRF-9、抗GAPDH、山羊抗兔(H+L) HRP和山羊抗鼠(H+L) HRP购自美国Affinity公司;Lipofectamine3000转染试剂购自美国ThermoFisher公司;ECL底物发光试剂盒购自中国武汉Abbkine公司;RNA反转录试剂盒、荧光染料SYBR购自上海ToloScript公司。

1.2 实验药物Hemin(批次号：52180;纯度>96%)购自美国sigma公司,Hemin用氢氧化钠标准溶液充分溶解配成10 mmol/L的母液,-20℃保存;在实验前用配制好的细胞培养基稀释母液至所需使用的浓度。

1.3 实验方法

1.3.1细胞培养与转染 HepG2、HepG2.2.15 细胞培养：向DMEM培养基中加入10%FBS和1%的双抗配制成新鲜培养基,对于HepG2.2.15细胞每100 ml培养基中加入320 ng遗传霉素G418,然后在5% CO2、37 ℃培养箱里培养,待细胞生长至90%时,用胰酶消化2 min,1 ∶2传代培养。等细胞长到对数期进行均匀铺板,等细胞融合至60%～70%,用新鲜培养基换液后对细胞进行药物处理48 h后进行qRT-PCR、Western blot 检测,或进行siRNA转染24 h,用药物处理48 h后再进行qRT-PCR、Western blot 检测。

1.3.2CCK-8实验 将细胞株进行传代,离心后用配制的细胞培养基重悬,进行细胞计数,以5×103个/孔的密度铺进96孔板中。待细胞贴壁后,加入不同浓度的Hemin(0、5、10、20、50、75、100 μmol/L)置于37 ℃培养箱培养孵育6 d,每3 d换液1次。到待测时间后,以1 ∶10的比例将CCK-8试剂和提前配制的培养基混合,吸尽培养基,加入配好的溶液,1 h后酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.3.3HBV相关指标定量检测 收集HepG2-HBV1.3经过药物处理48 h及转染小干扰RNA(Si RNA)24 h后再经过药物处理后的细胞上清液;收集HepG2.2.15细胞经过不同药物处理2、4、6 d 后的细胞上清液,用美国雅培全自动化学发光分析仪i4000SR检测上清液中的乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)。

1.3.4实时定量PCR分析 通过使用两步逆转录聚合酶链式反应定量分析来测量基因表达。通过TRIzol提取总RNA,在260 nm处评估提取的RNA的浓度;然后逆转录为cDNA,GAPDH被用作定量的内参,引物设计序列见表1。然后进行RT-qPCR测定,反应条件：95℃预变性30 s,40个循环包括95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,测定HO-1、IFN-β的mRNA表达水平。

表1 引物序列

1.3.5蛋白免疫印迹实验 加入裂解缓冲液(PIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制剂=100 ∶1 ∶1)以裂解细胞并获得全细胞蛋白质裂解物。4℃离心去沉淀后,吸出细胞上清液。用BCA进行蛋白定量。随后以1 ∶4比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,在100 ℃沸水的水浴锅中水浴10 min使蛋白质变性,随后将蛋白质信息转至PVDF膜上,转膜结束后,进行切膜,切分成所需的分子量条带,再将条带都放入快速封闭液中封闭1 h。封闭结束后多次洗膜。置条带于HO-1抗体(兔源单抗1 ∶2 000)、MxA抗体(兔源单抗1 ∶1 000)、p-IRF-3(兔源单抗1 ∶1 000)、IRF-3抗体(兔源单抗1 ∶1 000)、IRF-9抗体(兔源单抗1 ∶1 000)、GAPDH(鼠源多抗1 ∶5000)一抗稀释液中,摇床上4℃慢摇过夜,再用TBST缓冲液洗膜5次,每次5 min;根据一抗来源不同,分别放入山羊抗兔或鼠的二抗(1 ∶5 000)中室温下孵育1 h,然后再TBST缓冲液洗膜;显影液1 ∶1配制,滴于膜上,置于化学发光成像仪内显影。

2 结果

2.1 Hemin诱导HO-1的表达实验中选择了不同浓度Hemin作用于两种细胞系2 d诱导HO-1,结果显示,HO-1的表达水平以剂量依赖的方式增加(图1)。为了测定Hemin药物的细胞毒作用,通过CCK-8法对HepG2、HepG2.2.15细胞进行细胞毒性检测。结果显示,浓度在5～50 μmol/L之间的Hemin持续作用细胞6 d后,对细胞不产生杀伤作用;而浓度在75 ～ 100 μmol/L之间的Hemin处理细胞会对细胞产生细胞毒作用(图2)。

图1 不同浓度Hemin对HO-1的诱导

图2 不同浓度的Hemin对HepG2、HepG2.2.15的生长抑制程度

2.2 HO-1对HBV的体外抗病毒活性实验结果显示不同浓度Hemin处理HepG2.2.15细胞组的HBV-DNA、HBeAg、HBsAg与对照组相比表达降低(图3A),并与Hemin浓度成反比,当50 μmol/L Hemin浓度作用细胞时,对HBV-DNA、HBeAg有明显的抑制作用,差异有统计学意义(F=24.19,P<0.001;F=33.37,P<0.001),而对HBsAg的抑制没有HBV-DNA、HBeAg明显;对HepG2-HBV1.3细胞同样表现出HBV-DNA、HBeAg降低的抗病毒效应(图3B),当50 μmol/L Hemin浓度作用细胞时同样表现更明显的抗病毒效应(F=92.68,P<0.001;F=53.61,P<0.001)。

图3 HO-1体外抗病毒效应

2.3 HO-1通过增强I型干扰素反应来发挥抗HBV作用不同浓度Hemin作用于HepG2-HBV1.3、HepG2.2.15细胞2 d,图4显示Hemin以剂量依赖的方式增强了IFN-β的mRNA表达以及HO-1、IRF-3、IRF-9及下游抗病毒蛋白MxA的表达;在50 μmol/L Hemin浓度作用下IFN-β的表达量明显增高,差异有统计学意义(HepG2-HBV1.3：F=122.68,P<0.001;HepG2.2.15：F=289.3,P<0.001)(见图4)。

图4 Hemin诱导HO-1增强IFN反应

2.4 Si-HO-1可以逆转HO-1发挥的抗病毒作用为了确定HO-1诱导的I型干扰素上调和抗病毒作用是否涉及HO-1,设计HO-1 siRNA(si-HO-1)或NC-siRNA(si-NC)转染HepG2-HBV1.3细胞后,再用Hemin刺激诱导;不做处理的为空白对照组,Hemin诱导的为阴性对照,结果表明,与si-NC和阴性对照组相比,si-HO-1处理组的HBsAg、HBeAg的表达有所增高;HO-1、IFN-β的mRNA表达降低,IRF-3、IRF-9及下游的抗病毒蛋白MxA的分子表达均有所下降,说明si-HO-1处理组在一定程度上逆转了Hemin抗病毒作用(图5)。

2.5 HO-1可以增强IFN-α的抗病毒效应IFN是一种具有免疫调节和抗病毒作用的细胞因子,是临床治疗慢性乙型肝炎的首选药物之一;可以通过诱导具有抗病毒特性的ISG来增强免疫功能。然而,IFN治疗有一些局限性,如成本过高、停药后的反弹,大量患者在长期使用后出现耐药性等副作用。因此,为进一步证明了HO-1联合现有的IFN-α发挥更强的抗病毒作用,设计Control、Hemin、IFN-α和Hemin+IFN-α组分别作用2、4、6 d,实验结果显示联合用药组发挥更强的抗病毒作用,第6天时HBsAg、HBeAg较第2、4天更明显,HBV-DNA也表现出相似的结果,可见联合作用抗病毒效应与时间有相关性(图6)。

图6 Hemin与IFN-α联合作用于HepG2.2.15细胞的抗病毒效应

3 讨论

乙型肝炎病毒是世界范围内最常见的慢性病毒病原体,是已知最小的引起人类致病的DNA病毒之一,约3.2 kb,可通过血液或人体分泌物进行传播。病毒通过独特的HBV pgRNA中间体进行复制,最终在核内转化为共价闭合 DNA(cccDNA),利用不同的启动子,转录出4种mRNA,编码多种不同病毒蛋白(HBsAg、HBeAg、HBcAg、RT等)并逆转录出 HBV DNA[6]。HBV标志物是评估 HBV 感染、肝炎和其他疾病不可或缺的工具。HBV-DNA、HBsAg和HBeAg是最常用的诊断HBV感染及预测治疗期间病情复发和确定何时结束治疗的有效血清标志物[7]。

HBV感染细胞后,会激活机体先天免疫系统,宿主细胞释放IFNs,IFNs介导的抗病毒作用及其重要。IFNs是一种分泌型蛋白,可以由细胞识别不同病原菌后产生。IFNs与细胞表面的受体结合,开始激活JAK-STATs通路;磷酸化的信号转导转录激活因子1/2(signal transducer and activator of transcription1/2,STAT 1/2)与干扰素调节因子-9 (interferon regulatory factor-9,IRF-9)结合,形成复合物干扰素刺激基因因子-3 (IFN-stimulated gene factor-3,ISGF-3);进一步,ISGF-3与核内干扰素刺激反应元件结合,诱导一系列干扰素刺激基因的表达,如抗黏液病毒蛋白A(MxA)、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-Oligoadenylate synthetase,OAS)、双链RNA依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR);这些干扰素刺激基因通过多种机制在病毒复制的不同的阶段阻止病毒的复制[8]。IFN-JAK-STAT轴是经典的抗HBV信号通路;在病毒感染之前或期间激活,增强先天免疫反应从而增强IFN的表达将有助于提高宿主对抗病毒的能力。因此诱导或恢复I型IFN产生和相应抗病毒反应的方法可能增强抑制宿主中的HBV复制。已知HO-1广谱抗病毒作用主要涉及3个方面：HO-1及下游产物直接抑制病毒复制、增强宿主细胞I型IFN反应间接抑制病毒复制、抑制病毒感染引发的炎症损伤[9];实验结果表明,HO-1有效地抑制了HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表达,HO-1对HBeAg的抑制能力强于HBsAg,这可能与HO-1及其产物可以直接抑制HBV的核心蛋白及cccDNA相关[5]。研究[10]显示通过激活HO-1介导的I型IFN反应在抑制病毒复制中发挥重要作用。实验结果也显示Hemin处理组的IFN-β也呈现高表达;不同浓度的Hemin不仅剂量依赖性诱导HO-1并且剂量依赖性诱导JAK-STAT通路中的IRF-9、MxA;但对于HepG2.2.15细胞来说,MxA在此细胞系中表达并不明显,这可能与外源性的病毒基因组的整合,导致细胞系的基因组重排和染色体变异有关,从而影响基因的表达相关[11];而在瞬时转染HBV-1.3的HepG2细胞中,MxA可以被轻易诱导。除了已被证明的HO-1及其产物可以通过降低HBV核心蛋白稳定性从转录层面直接抑制病毒复制,猜测HO-1的另一部分抗病毒作用可能是通过激活IFN-JAK-STAT轴来诱导ISG来发挥的。Lazear et al[12]研究认为IRF-3对响应病毒感染产生I型IFN和IFN刺激基因(ISG)至关重要。MA et al[13]也证明了IRF-3上有HO-1的特异性受体,HO-1可以与IRF-3特异性结合,并能促进其进入细胞核进行磷酸化诱导I型干扰素的产生来激活JAK-STAT通路。这表示HO-1可通过与IRF3的相互作用对IFN-β诱导来发挥抗病毒作用。

本实验中,si-HO-1组能逆转Hemin处理组HO-1诱导的抗病毒效应及相关分子的表达;并且si-HO-1组IFN-β mRNA表达也低于Hemin诱导组,推测Hemin发挥的抗HBV效应是通过HO-1来实现的;但是否也存在依赖IRF-3磷酸化及核转位诱导I型IFN有待进一步研究。

HO-1不仅可以发挥一定的抗病毒作用,在细胞的抗炎、抗氧化、抗凋亡等细胞保护作用方面也被广泛研究。研究较多的是Nrf2/HO-1信号通路,揭示了HO-1在减轻氧化应激和组织保护中发挥作用[14]。HO-1诱导的细胞损伤保护作用和多重抗病毒能力的结合,让HO-1成为一个潜在的临床抗HBV药物。再者HO-1相关的诱导剂(如血红素、环氧合酶抑制剂、他汀类药物或雷帕霉素等)已是被批准用于治疗人类疾病的药物[15]。实验结果表明联合Hemin与现有的抗HBV药物IFN-α发挥出更好的抗HBV作用,值得注意的是,本身实验结果显示,在HepG2.2.15细胞系中,低浓度的IFN-α在不同时间作用下并不能降低HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的表达,后期实验使用高浓度的IFN-α作用于HepG.2.15细胞表现出了抗病毒性。低浓度的IFN-α在体内能发挥抗病毒作用得益于人体强大的免疫调节功能,离开机体后,缺乏这种先天免疫,很难发挥抗病毒效应[16],有研究[17]显示HBV的抗原或其核心蛋白等能够抑制重要的抗病毒蛋白MxA来拮抗IFN-α的抗病毒作用。而HO-1与IFN-α联合作用时,HO-1能够降低核心蛋白的稳定性的表达,可能在一定程度上恢复了IFN-α的抗病毒活性,联合作用时发挥了更强的抗病毒作用。

综上所述,本研究阐明了Hemin诱导的HO-1表达与HBV复制之间的相关性。HO-1的上调以剂量依赖的方式抑制HBV-DNA复制及HBsAg、HBeAg的分泌,可能是通过促进IRF-3的磷酸化来增加I型干扰素的表达从而激活JAK-STAT通路来发挥抗病毒效应;并且联合现有的抗病毒药物IFN-α能发挥更强的抗病毒作用,HO-1具有显著的治疗潜力,可能有助于肝炎患者的治疗,但需要进一步研究。