化湿败毒方干预COVID-19细胞因子风暴的网络药理学研究 *

李崇将 邹小凡 周 茜

（吉安市中心人民医院呼吸与危重症医学科，江西 吉安 343000）

自新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情发生以来，截至目前我国累计确诊超过100 000 人次，累计死亡超过4800人次，目前国内疫情得到了有效控制。除了现代医学以及医药的支持，传统中医药也起了非常大的作用。国家卫生健康委员会先后发布了8 版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》并推荐中药方剂，其中化湿败毒方为重症患者推荐使用方案［1］。

细胞因子可以分为白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等，其在机体内相互促进或相互制约，形成复杂的细胞因子免疫调节网络［2-5］。细胞因子既可发挥免疫调节作用，在一定条件下也可以参与多种疾病的发生，甚至引发细胞因子风暴即细胞因子风暴综合征，导致多器官损害、功能衰竭。细胞因子风暴多为感染、药物等多种因素诱发的全身系统性炎症反应。在病毒感染机体时，急性炎症引起促炎细胞因子或趋化因子释放，T 淋巴细胞活化，引起免疫效应细胞释放促炎因子和趋化因子，随着病程发展产生失控的过激反应，使得促炎因子和趋化因子暴增，并通过自分泌、旁分泌等级联反应活化更多的免疫细胞，造成免疫调控网络失衡，形成细胞因子风暴［4，5］。细胞因子风暴在疾病迅速进展中起重要作用。

本研究使用网络药理学的方法，筛选出化湿败毒方作用靶点与COVID-19 病理靶点，通过基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，研究化湿败毒方干预细胞因子通路、关键基因进而达到治疗效果的机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件TCMSP 数据库（http：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）、Drugbank 数据库（https：//go.drugbank.com/）、OMIM 数 据 库（https：//www.omim.org/）、GeneCard 数 据 库（https：//www.uniprot.org/database/DB-0030）及GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。

1.2 研究方法

1.2.1 中药复方作用靶点的筛选利用TCMSP 对生麻黄、杏仁、甘草、藿香等复方中药的药物作用靶点进行了研究。其中矿物药生石膏的靶标从Drugbank 数据库获得。此外，用OMIM 数据库、GeneCard 数据库以及GEO数据库筛选COVID-19的病理靶点。

1.2.2 筛选复方中药治疗COVID-19的最佳靶点将化湿败毒方的潜在活性成分及作用靶点通过Cytoscape 建立“活性成分-靶点-疾病”网络。网络中节点表示化合物及靶点，节点之间的互作用关系由边表示。节点的重要性可以通过自由度来评估。

1.2.3GO和KEGG功能注析使用R 包“ClusterProfiler”对目标基因进行功能注释，以全面探讨这些目标基因的功能相关性。GO和KEGG 被用来评估相关的功能类别。P值和Q值均小于0.05 的GO 和KEGG 富集通路被认为是显著性类别。

1.3 统计学方法所有统计分析均采用R 语言（Version 3.6）进行。所有统计检验均为双侧，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

通过网络药理学的方法对目标进行分析的过程如图所示，用于帮助确定生麻黄、杏仁、生石膏、甘草、藿香等中药对COVID-19 的作用。本研究首先通过OMIM数据库以及GeneCard 数据库（Relevance score≥1）探讨COVID-19 的相关靶点1130 个。随后，我们对TCMSP 数据库分别基于生麻黄、杏仁、甘草、藿香等13 种中药，以生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 作为阈值进行筛选，获取所含药物有效成分以及有效成分所作用的靶点。此外矿物药生石膏的靶标从Drugbank 数据库获得，最终得到258 个药物靶点。使用Cytoscape 通过网络图的形式展示中药成分与靶点的作用关系。然后将药物靶点与前者的1130 个疾病靶点取交集，得到47 个交集靶点。见图1。

图1 化湿败毒方和COVID-19的靶点维恩图

为进一步探讨中药复方影响COVID-19的潜在机制，利用R 包“Clusterprofiler”对47 个靶点基因进行GO 富集和KEGG 通路分析。GO富集结果显示，基因主要涉及的通路为对脂多糖的反应、膜筏、受体-配体活性、细胞因子活性。见图2。KEGG富集结果显示，基因主要涉及的通路为脂质与动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、辅助性T 细胞17（Th17）分化等信号通路。见图3。我们进一步使用Cytoscape 软件，生成了中药对抗COVID-19靶点的网络可视化和核心靶点相关通路的交互图，图表能清晰地显示复方中药调控靶点的分子机制以及其对COVID-19的调控作用。见图4。

图2 GO富集分析气泡图

图3 KEGG富集分析气泡图

3 讨论

中医学在传染病的防治中积累了丰富的学术理论和临床经验，国家卫生健康委员会针对重型疫毒闭肺证的治疗推荐使用化湿败毒方，化湿败毒方由《伤寒论》中麻杏石甘汤、《金匮要略》中葶苈大枣泻肺汤、《温病条辨》中宣白承气汤、《医原·湿气论》中藿朴夏苓汤4首方剂组合化裁而制，该方清肺平喘、泄热开闭、燥湿健脾、活血祛瘀、扶正祛邪。

本研究共筛选出47 个化湿败毒方治疗COVID-19 的潜在靶点，中药作用于治疗的核心成分有169 种，包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、谷甾醇、儿茶素等。研究［6］显示槲皮素在降低COVID-19 重症患者重要标记物血清碱性磷酸酶（ALP）、快速C 反应蛋白（q-CRP）和血清乳酸脱氢酶（LDH）水平方面是安全有效的，并可缩短住院治疗时间。多个研究显示山柰酚具有抗炎、抗病毒的作用［7］。

有研究［8］显示，重型COVID-19 患者一旦出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS），则病死率接近50%。细胞因子风暴是发生重症COVID-19 的重要原因，也是加重患者病情甚至造成患者死亡的重要因素［9，10］。研究［11，12］显示化湿败毒方中所包含的麻杏甘石汤具有调节IL-6、人干扰素诱导蛋白10（IP-10）、TNF-α 等细胞因子作用。本研究发现化湿败毒方可调节受体-配体活性、细胞因子活性、IL-17 信号通路、Th17 细胞分化等信号通路。

研究提示化湿败毒方在干预COVID-19 重型、危重型患者的作用机制可能与清除病原体、抑制炎症反应、阻断炎症风暴及改善肺组织损伤有关［13］。研究［14，15］发现，小鼠感染流感后，可以引起炎症因子水平升高，其机制可能与活动依赖神经特异启动子（c-FOS）基因表达相关，在放射性肺炎中也有类似表现，其机制可能与HSB 基因相关。化湿败毒方可以干预细胞因子、调节细胞因子风暴，进而起到治疗重症COVID-19 的效果。

综上所述，本研究通过运用网络药理学方法探究化湿败毒方治疗重症COVID-19 的潜在作用机制，总结出化湿败毒方改善细胞因子、调节免疫微环境可能的主要靶点、信号通路及核心基因。本研究也体现了中药治疗COVID 具备多成分、多靶点、多通路的特点，为化湿败毒方治疗重症COVID-19 提供理论依据。但文章仅从理论和网络预测角度分析，后期需对核心成分、靶点、核心基因及通路进行验证。