miR-155 靶向SMAD2 在小鼠狼疮肾炎足细胞损伤和炎性反应中的影响

张 洁，徐璐瑶，吴昱升，王 蓉，杨岚茵，蓝梦麟，林雨倩，黄艳琴，林 栩

（1.右江民族医学院附属医院肾内科，广西 百色 533000；2.广西免疫相关性疾病医学科研基础保障重点实验室，广西 百色533000）

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中较常见的并发症之一，也是导致SLE 患者死亡率增加的主要危险因素[2]。LN 直接影响肾脏的功能，可能导致严重的肾损害和衰竭[3]，因此针对LN 展开相关研究至关重要。 MicroRNA-155 是微小RNA(miRNA)超家族的成员，在调节血细胞生成、炎症和免疫应答中起重要作用[4]。miR-155 是LN 的重要危险因素[4,5]，有研究表明，miR-155 对足细胞损伤有影响[6,7]。SMAD 家族成员2（SMAD2）作为TGF-β 的下游分子，在将TGF-β 超家族配体的细胞外信号转运到细胞核过程中起重要作用[11,12]，而且研究发现SMAD2 参与肾纤维化进程[13]。生物信息学分析及文献报道表明,miR-155 与SMAD2 具有靶向调控关系[11,14]，但其在LN 中的作用机制尚不明确。本研究旨在探索miR-155 调控SMAD2 表达在LN 中发挥的作用，为进一步理解LN 的发病机制，以及探索新的治疗策略和靶向治疗提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

1.1.1 实验动物 6 周龄MRL/lpr 雌性小鼠40 只及C57BL /6 雌性小鼠8 只，江苏华创信诺公司,许可证编号：SCXK(苏)2020-0009。喂养、取材以及实验等操作均于广西百色市右江民族医学院动物实验中心（SPF 级）进行,适应环境一周后用于实验。本实验由广西百色市右江民族医学院伦理委员会审批通过后开展相关性实验，审批号：20200630001，整个实验过程全部严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》规范要求进行。

1.1.2 实验试剂 苏木素（Sigma）、伊红、二甲苯（国药集团）、AAV9 腺相关病毒（汉恒生物）、尿蛋白试剂盒 (南京建成) 、TRIzol Reagent( invitrogen) 、miRNA 逆转录试剂盒、SYBR Master Mix（翌圣生物）、内参U6、引物(上海生工) 。RIPA 裂解液(英文特生物) 、PMSF、20X TBST、牛血清白蛋白、4%多聚甲醛（北京索莱宝）、PAGE 凝胶快速制备试剂盒、BCA 试剂盒 (上海雅酶生物) 、PVDF 膜（美国Millpore）。 P-cadherin 、nephrin 和SMAD2 抗 体(Abcam) 、ECL 发光剂、GAPDH 、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)HRP (江苏亲科生物) 。浓缩型正常山羊血清、光（CY3）标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物）、 IL-6 和TNF-α、DAPI（碧云天）、抗荧光淬灭剂（southernbiotech）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 (1) 空白组:C57BL/6 雌性小鼠尾静脉注射生理盐水（0.2 mL/只）；(2)模型组：MRL/lpr 雌性小鼠尾静脉注射生理盐水（0.2 mL/只）；(3) AAV9-miR-NC 组：MRL/lpr 雌性小鼠尾静脉注射miR-155 上调阴性对照AAV（0.2 mL/只）；(4) AAV9-miR-155组：MRL/lpr雌性小鼠尾静脉注射miR-155 上调AAV（0.2 mL/只）；(5) AAV9-miR-anti组：MRL/lpr雌性小鼠尾静脉注射miR-155抑制AAV（0.2 mL/只）；(6)AAV9 -miR-anti-NC 组：MRL/lpr雌性小鼠尾静脉注射miR-155 抑制阴性对照AAV（0.2 mL/只）。

1.2.2 miR-155-5p 靶基因预测 通过在线靶基因预测网站Target genes(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-155-5p 与SMAD2 的结合位点。

1.2.3 双荧光素酶报告基因检测实验 构建LT-m-smad2-3UTR-wt、LT-m-smad2-3UTR-mut质粒（汉恒上海），通过Lipofectamine3000 转染试剂分别 将 LT-m-smad2-3UTR-wt 和 LT-m-smad2-3UTR-mut 分 别 与 miR-155-5pmimics 和miR-155-5p-NC 共转染至293T 细胞，转染48 h 后检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.2.4 HE 染色 取肾脏组织经4%多聚甲醛固定组织样本，固定时间为24 h，使用常规梯度乙醇进行脱水处理，然后用二甲苯进行透明化处理，接着进行石蜡包埋。随后进行超薄切片处理，常规脱蜡，苏木素染色，使用盐酸乙醇进行分化处理，接着进行伊红复染。最后使用梯度乙醇进行脱水处理，并使用中性树脂进行封片。最终在光镜下观察组织的病理变化，并拍摄照片以进行进一步的分析。

1.2.5 尿蛋白水平 给予处理最后1 周收集小鼠尿液样本，并使用考马斯亮蓝（CBB 法）来检测尿液中的蛋白质含量。根据试剂盒的说明书进行操作，使用酶标仪在光波长为595 nm 测定光密度（OD）值。然后，根据以下计算公式计算尿液中蛋白质的浓度：尿蛋白浓度（mg/L）= 标准品浓度（524 mg/L）×（测定OD 值-空白OD 值） /（标准OD 值-空白OD 值）。

1.2.6 实时定量 PCR 法检测 用 Trizol 提取各组细胞总RNA，测定RNA 浓度，然后将RNA 反转录合成 cDNA,具体操作按照逆转录试剂盒说明书进行，其以内参为U6，LightCycler96 实时荧光定量PCR 仪 进 行 扩 增。结 果 以 2-△△CT法 计 算 分 析miR-155 的相对表达量。引物见表1。

表1 qRT-qPCR 引物序列Tab 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.7 Western blot 实验 取冻存的肾脏组织制成匀浆，加入适量预冷 RIPA 缓冲液，充分混匀后在冰上裂解30 min。随后离心提取总蛋白，并使用二巯基甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取等质量的蛋白进行上样，经凝胶电泳分离样品蛋白，然后进行蛋白转膜。取目的条带后使用牛血清白蛋白制成的封闭液，在4 ℃下封闭3 h。封闭液稀释一抗（nephrin、P-cadherin 和SMAD2）制成孵育液，稀释比例为1∶1 000，在4 ℃过夜孵育。之后使用TBST 漂洗样品3 次，加入稀释比例为1∶6 000 的对应二抗孵育液，在室温孵育2 h。再次用TBST 漂洗样品3 次，最后使用ECL 发光剂进行显影。分析使用Image J软件对各组蛋白的灰度进行分析，以GAPDH 作为内参。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.2.8 免疫荧光染色 取肾脏组织经4%多聚甲醛固定后，使用梯度酒精进行组织脱水、透明化、浸蜡和包埋切片。然后，使用二甲苯和酒精分别进行脱蜡处理。接下来进行抗原修复，将组织切片放入山羊血清中进行室温封闭，封闭时间为30 min。之后，加入IL-6、TNF-α 的目标抗体进行孵育，将孵育过的切片放入4 ℃的湿盒中避光孵育过夜。随后，分别滴加荧光标记物，将切片放入湿盒中，在37 ℃孵育1 h，然后滴加DAPI 进行染核。最后，使用含有抗荧光淬灭剂的封片液进行封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.9 统计学方法 采用 SPSS23.0 统计软件，计量数据用以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-155 与SMAD2 存在靶向互作的关系

靶基因预测网站Target genes 结果显示，miR-155-5p 与SMAD2 的3’-UTR 结构域有结合区域，见图1。

图1 miR-155-5p 与SMAD2-3' UTR 靶位点结合示意图Fig 1 The binding diagram of miR-155-5p and SMAD2-3'UTR target site

2.2 双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-155与SMAD2 的靶向关系

转染野生型SMAD2 基因表达载体WTSMAD2 后，与NC mimics 对 照 组 相 比，miR-155-5p-3' UTR-WT 的luciferase 的表达显著下调（t=23.93，P＜0.001），而转染突变型SMAD2 基因表达载体MUT- SMAD2 后，与NC mimics 对照组相比，miR-155-5p-3' UTR-MUT 的luciferase 的表达差异不 显 著（t=0.126 9，P=0.905 1＞0.05）可 见，miR-155-5p 可以靶向调控SMAD2 的表达，见图2。

图2 双荧光素酶实验验证miR-155-5p 靶向结合SMAD2Fig 2 Double-luciferase experiment to verify the targeted binding of miR-155-5p to SMAD2

2.3 尿蛋白水平

CBB 法检测各组24 h 尿蛋白含量显示，各组与空白组相比 ，尿蛋白呈现升高的趋势（P＜0.05）。和模型组、AAV9-mir-NC 组相比， AAV9-miR-155组 尿 蛋 白 升 高（P＜0.001）；和 模 型 组 、AAV9-miR-anti-NC 组相比，AAV9-miR-anti 组尿蛋白呈降低趋势（P＜0.001）；模型组、AAV9-miR-NC组和AAV9-miR-anti-NC 组的尿蛋白含量则差异不明显（P＞0.05）。见图3。

图3 小鼠尿蛋白含量Fig 3 The levels of urinary proteins in mice

2.4 HE 染色

空白组：肾脏结构清晰，未见明显增生变性。模型组镜下出现肾小球系膜细胞增生 ， 伴有炎性细胞浸润。AAV9-miR-155 组有肾小球细胞较明显增生， 且有较多炎性细胞浸润 。AAV9-miR-anti 组则肾组织结构轻度异常，肾实质可见少量炎症细胞浸润，个别肾小球基底膜增厚。AAV9-miR-NC组、 AAV9-miR-anti-NC 组则镜下亦可见肾组织结构异常、肾小球系膜细胞增生和炎性细胞浸润，病理改变严重程度与模型组相似。见图4。

图4 小鼠肾组织HE 染色（200×）Fig 4 The HE staining of renal tissue from mice（200×）

2.5 各组小鼠中miR-155 RNA 的表达水平

结果显示，与空白组相比，模型组、AAV9-miR-155 组 和AAV9-miR -NC 组miR-155-5p 的 表 达 水 平 均 上 调（P＜0.05），和 模 型 组、AAV9-miR-NC 组 相 比，AAV9-miR-155 组miR-155-5p RNA 表达水平增加较显著（P＜0.001），而AAV9-miR-NC 组和模型组相比差异不明显（P＞0.05）；与空白组相比，模型组、AAV9-miR-anti 组和AAV9-miR-anti-NC 组miR-155-5p 表达水平均有上调（P＜0.05），和模型组、AAV9-miR-anti-NC 组相比，AAV9-miR-anti 组miR-155-5p RNA 有 降 低 趋势（P＜0.001），而AAV9-miR-anti-NC 组和模型组相比差异不明显（P＞0.05）。见图5。

图5 小鼠miR-155 RNA 的表达情况Fig 5 The expression of miR-155 RNA in mice

2.6 过表达及抑制miR-155 对nephrin、P-cadherin和SMAD2 蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组 P-cadherin（P＜0.01）、nephrin （P＜0.05）和SMAD2 （P＜0.001）蛋白表达均降低。 与模型组、AAV9-miR-NC 组相比，AAV9-miR-155 组nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表达量显著降低（均P＜0.05）；而与模型组、AAV9-miR-anti-NC 组 相 比， AAV9-miR-anti 组nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表达增加（均P＜0.05）；另 外，模 型 组、AAV9-miR-NC 组、AAV9-miR-anti-NC组nephrin、P-cadherin和SMAD2蛋白差异不明显（P＞0.05）。结果提示：模型组相对空白组SMAD2 蛋白表达降低，并且小鼠足细胞有所损伤；过表达miR-155-5p 抑制SMAD2 蛋白表达，并促进小鼠足细胞损伤，抑制miR-155-5p 可使SMAD2 蛋白表达增加，而小鼠足细胞损伤则有所改善。见图6、7。

图6 小空白组和对照组nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表达情况Fig 6 The protein expression of nephrin， P-cadherin and SMAD2 in blank and control groups

图7 过表达和抑制miR-155 对nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表达影响Fig 7 Effects of overexpression and inhibition of miR-155 on nephrin， P-cadherin and SMAD2 protein expression

2.7 过表达及抑制miR-155 表达对IL-6、TNF-α 表达的影响

与空白组比较，其余各组 IL-6、TNF-α 蛋白荧光强度均表现为增加趋势。 与模型组、AAV9-miR-NC 组 相 比， AAV9-miR-155 组IL-6、TNF-α 荧光强度均增加较显著；与模型组、AAV9-miR-anti-NC组相比，AAV9-miR-anti组IL-6、TNF-α 则降低较显著，模型组、AAV9 -miR-NC 组、AAV9-miR-anti-NC 组荧光强度未见明显差异。见图8、9。

图8 各组肾组织 TNF-α 免疫荧光（400×）Fig 8 The kidney tissue TNF-α immunofluorescence for each group （400×）

图9 各组肾组织 IL-6 免疫荧光（400×）Fig 9 The kidney tissue IL-6 immunofluorescencefor each group （400×）

3 讨论

SLE 是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其特征是异质性表现和多种自身抗体的产生［1，15，16］。目前，SLE 的发病机制尚不清楚，阳光照射或病毒感染可在具有遗传易感性的个体中诱发疾病，其中女性是其中最脆弱的群体［1］。诱因激活先天免疫和适应性免疫，从而导致T 细胞激活自身反应性B 细胞，并导致免疫复合物沉积在组织中，引起自身免疫级联反应，反应可能仅限于单个器官也可能涉及全身［17］。LN 是SLE 最常见和最严 重的并发症之一，大约25%～50%的SLE 患者合并有LN，LN 显示炎症细胞因子高表达、肾小球肾炎和肾功能受损［15，16］，并且在 10%～20% 的患者中作为疾病的初始表现进展为终末期肾病［18］。目前LN 疗法在诱导缓解或预防新发作方面不够有效，并非所有患者都表现出足够的治疗反应［19］。所以，对LN 发病机制进行研究，有助于探究疾病的治疗策略，降低疾病的发生率。miRNA 在SLE 以及LN 中的肾脏发育和免疫病理、生理过程中起着关键作用，miRNA 失调可能导致肾脏细胞增殖异常、炎症和肾脏纤维化［9，20，21］。

miRNA 是一种非编码RNA 分子，由18～25 个核苷酸组成，可通过与mRNA 的3′非翻译区（3′UTR）结合来调控目标基因的表达［4，9］。miRNA通过调控靶基因的表达，在细胞增殖、分化和凋亡等各种生理和病理过程中发挥重要作用［4］。miRNA 的异常表达会导致免疫性疾病，如自身免疫性疾 病 和 自 身 炎 症 性 疾 病［22，23］。miR-155 是miRNA超家族的成员，介导先天性和适应性免疫应答，调节血细胞生成、炎症和免疫应答［4］，参与SLE 进展和器官损伤［9］以及LN 的炎症过程［4］。研究表明，外泌体miR-155 在SLE 患者中上调，外泌体miR-155 表达水平可作为诊断SLE 和LN 的潜在生物标志物［9］。此外，在狼疮患者中的血液、尿液、外周血单核细胞、血浆中也发现了显著上调的miR-155［5，8，10］。这些研究表明，miR-155 参与LN 炎症进程，并呈高表达。在本研究中，与空白组相比，模型组的miR-155 表达量增加，这与前人研究结果一致。

有研究发现，miR-155 的过表达可以促进足细胞中炎症分子的产生，从而加重足细胞损伤［7］。足细胞在肾小球滤过和肾功能的维持中起着关键作用，而LN 蛋白尿的主要原因是足细胞损伤，其中细胞死亡或脱离导致足细胞丢失是肾小球疾病进展的关键，预防足细胞损伤在LN 治疗中至关重要［15，16，24］。此外，足细胞在LN 中可能通过充当抗原呈递细胞或通过分泌促炎细胞因子促进炎症反应［25］。课题组前期研究发现，在 TGF-β1 干预的足细胞损伤模型中，CD2AP 与 podocin、synaptopodin表达均降低而miR-155 升高，还发现过表达miR-155 可 负 调 节 podocin、synaptopodin、CD2AP的表达，而低表达miR-155 可使 podocin、synaptopodin、CD2AP 表 达 上 调［6，10］。可 见，过 表 达miR-155可促进足细胞损伤，抑制miR-155 表达可改善足细胞的损伤，这与前人的研究结果一致，因此推测miR-155 可通过促进足细胞损伤参与LN 炎症进程。然而，目前miR-155 在LN 的调控机制并未完全清楚。

Smad 蛋白家族是近年来通过遗传筛选方法在无脊椎动物中鉴定出的一种细胞内信号蛋白［26，27］。已经表明，Smad 蛋白是TGF-β 信号通路的关键中间体。Smad 蛋白家族是将TGF-β 与其受体结合产生的信号从细胞质传递到细胞核的中间分子，在信号传递和调节下游靶基因的转录中发挥重要作用［26］。SMAD2 是SMAD 蛋白家族其中一员，为受体调节型 SMAD（R-SMAD），作为转录因子发挥功能［28］。TGF-β/Smad 信号通路介导了炎症和肾纤维化，其中TGF-β1 的介导因子包括Smad2 和Smad3，研究发现敲除Smad2 可显著减轻肾纤维化［13］。有研究报道，miR-155 可以和SMAD2 靶向结合［11，14］。本研究通过生物信息学分析发现miR-155-5p 与Smad2 的3′ UTR 存在相互补的结合位点，两者间可能存在较为可靠的靶向关系。进一步通过双荧光素酶报告基因检测结果显示， miR-155-5p 能够靶向调控SMAD2 的表达。

为了明确miR-155-5p 是否通过SMAD2 对LN起调控作用，本研究对小鼠进行腺相关病毒AAV9转染干预，分别上调和下调miR-155-5p 的表达，结果表明miR-155-5p 不仅可与 SMAD2 靶向结合，还负向调控 SMAD2 的表达。 此外，过表达miR-155-5p 可加重小鼠足细胞损伤和狼疮肾炎的炎性反应，而下调miR-155-5p 表达可改善小鼠足细胞损伤和炎性反应。综上，下调miR-155 可通过促进SMAD2 来改善小鼠足细胞损伤和肾脏的炎性反应，本研究为探索miR-155 在狼疮肾炎的作用提供了新思路。

作者贡献度说明：

张洁：实验设计与操作，论文撰写；徐璐瑶：数据整理与统计分析；吴昱升、王蓉、杨岚茵、蓝梦麟、林雨倩、黄艳琴：实验操作助手；林栩：研究指导，论文修改，经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。