TRPV4在眼病理生理功能中的研究进展

刘 歆,毕燕龙

0引言

瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道可以被认为是多个信号集成器来引导我们的感觉系统。TRP通道根据核苷酸序列同源性分为6个主要亚家族:锚蛋白(ankyrin,TRPA)、经典型(canonical,TRPC)、黑素瘤型(melastatin,TRPM)、粘脂(mucolipin,TRPML)、多囊蛋白(polycystin,TRPP)、以及香草醛(vanilloid,TRPV)[1-2]。其中香草醛家族包含4个亚型,分别为:TRPV1、TRPV2、TRPV3和TRPV4[1]。TRPV4属于瞬时受体电位香草醛受体的亚家族成员,于2000年从秀丽隐杆线虫无脊椎动物基因Osm-9的渗透敏感通道同源物中被发现[3]。TRPV4是一种非选择性阳离子通道蛋白,在哺乳动物中表达广泛,在脑、眼、肾和泌尿系统、胃肠道和胰腺、肌肉骨骼组织、上皮、血管内皮和血管周围平滑肌细胞中均有膜性表达。同时,TRPV4参与细胞肿胀、温度、机械牵张、剪切应力、渗透压和花生四烯酸代谢产物的调节。机械牵张或压力会激活细胞膜上的TRPV4,从而介导Ca2+内流,使胞质[Ca2+]i浓度增高,进而影响基因表达、细胞形态和细胞骨架构建[1-2,4-5]。

1 TRPV4在眼组织中的表达与功能

随着对TRPV家族的深入研究,TRPV4在角膜、晶状体、睫状体、小梁网和视网膜中均有功能性表达[6],结合其通过引起Ca2+通道开放而参与各种生理病理过程的特点,已成为很多眼科生理及病理发生发展机制的研究对象。

1.1TRPV4在角膜上皮中的表达与功能角膜上皮层由覆盖在眼球最表面的复层上皮细胞组成,起着屏障和保护角膜免受环境危害的功能。紧密连接是维持角膜上皮屏障功能的基础。研究发现TRPV4在兔角膜上皮细胞系中的功能性表达对紧密连接的正确建立非常重要,它于细胞分化末期高表达于角膜上皮最外层,参与调节紧密连接屏障功能的建立;同时,TRPV4也是表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对紧密连接的调节作用所必需的[7]。Lapajne等[8]发现小鼠上皮细胞均有TRPV家族基因的功能性表达,以TRPV4为主,接着是TRPV2和TRPV3,TRPV1的表达量最少。其中,TRPV4通过渗透敏感和热敏引起阳离子内流,促进半通道依赖的ATP释放,这种TRPV4-半通道-ATP信号轴可能是调节过度机械性、渗透性和化学性刺激引起的角膜疼痛的通道。Sun等[9]在大鼠急性高眼压模型中发现TRPV4可能通过TRPV4-ATP-P2X2通路影响角膜ATP浓度。TRPV4还是参与渗透压调节的重要离子通道,在容积控制的背景下,其在角膜上皮细胞中的功能已被研究。Pan等[10]用siRNA敲低TRPV4后,发现细胞调节性容积减少(regulatory volume decrease,RVD)的活性被抑制,表明TRPV4在调节角膜上皮内渗透压方面发挥重要作用。此外,TRPV4还参与了角膜上皮损伤修复过程,炎症因子大量释放是角膜损伤后引起纤维化的重要机制之一,Okada等[11]采用小鼠角膜烧伤模型,发现抑制TRPV4后可减轻纤维化;相反,他们还发现在受损的三叉神经中插入TRPV4基因可以通过上调神经生长因子(nerve growth factor, NGF)促进角膜上皮的愈合[12]。综上所述,TRPV4在维持角膜上皮稳态及损伤修复方面发挥复杂的功能。

1.2TRPV4在角膜内皮中的表达与功能角膜内皮层位于角膜最内层,是由六边形细胞组成的单层结构,通过机械屏障及离子泵功能,起着维持角膜正常厚度和透明度的重要作用。关于角膜内皮细胞是如何将液体从角膜基质驱动到前房仍然是一个悬而未决的问题。研究表明渗透压梯度、细胞膜电阻以及温度所引起的细胞Ca2+浓度变化是维持角膜透明的主要原因。2011年,Mergler等率先报道了TRPV4在人角膜内皮细胞系(HCEC-12)中存在功能性表达并作为热敏和渗透敏感性蛋白,在低渗和中等热度(<40 ℃)条件下可引起Ca2+向细胞内转移,并与水通道蛋白1(aquaporin 1, AQP1)或水通道蛋白4(AQP4)形成复合体发挥RVD活性[13-14]。与此同时,TRPV4还影响角膜内皮细胞的活性及存活率。TRPV4表达的上调会损害维持角膜稳态的结构和功能特性,具体表现为结构完整性的改变,并且增加药物对细胞活力丧失的敏感性[15]。研究表明,TRPV4通过其他可能涉及Na+/K+-ATP酶β-1转运亚基(ATP1B1)的机制调节细胞凋亡,这种活性离子转运介体被认为是Fuchs内皮营养不良(fuchs endothelial cell dystrophy, FECD)的靶位点之一,但FECD中内皮细胞的退变是否仅仅是由于ATP1B1的功能受损或与TRPV4的相互作用,有待进一步研究[16]。研究证实,TRPV4可通过下调PI3K/AKT信号通路并上调p38 MAPK信号通路来降低Bcl2/Bax比值,从而引起神经细胞的凋亡,但这是否使其致角膜内皮细胞凋亡的机制,仍需进一步研究[17]。

角膜内皮还受到机械力的作用,包括房水所产生的静水压力(hydrostatic pressure)和房水流体动力学继发的流体剪应力(hydrokinetic shear stress pressure)。关于机械力如何影响角膜内皮的完整性及其屏障功能知之甚少。Thériault等[18]通过将人角膜、组织工程角膜以及无内皮的人角膜分别组装在特殊设计的具有一定生理压力和模拟人眼房水流动速率的装置中发现角膜水肿和胶原纤维之间的间隙均有下降,说明房水压力动力对角膜内皮细胞连接完整性至关重要。众所周知,细胞通过对压力的反应,启动细胞骨架的结构变化,将机械信号转化为化学信号。其中液压,已被证明可以影响细胞骨架和肌动蛋白聚合[19]。TRPV4是一种对机械力非常敏感的离子通道蛋白,这种敏感性依赖于其与多种细胞和组织中纤毛的结合相关,如在输卵管细胞、间充质干细胞和气道上皮细胞中参与纤毛搏动频率与机械传导。在脊椎动物和(发育中)哺乳动物角膜内皮细胞中也发现了一种初级纤毛,其不仅可随着环境或压力的变化表现为突起或回缩,还可感知房水中离子组成及静水压,被推测在机械损伤后角膜内皮损伤修复中发挥作用[20-22]。静水压升高可激活血管内皮上的TRPV4引起Ca2+内流,导致血管通透性增加,而阻断TRPV4可更好地保留内皮完整性已在心、肺、胰等静脉高压中证实[5,23-24]。TRPV4介导的“力-化学信号”转导是否是通过Ca2+内流调控细胞骨架结构,从而调节内皮细胞的屏障功能,这一问题有待进一步研究。

1.3TRPV4在晶状体中的表达与功能晶状体借悬韧带固定于后房中,房水的成分及其渗透压的稳定性对维持晶状体的正常代谢发挥重要作用。近年的研究表明,TRPV4不仅表达于晶状体上皮细胞中[25],在晶状体纤维细胞中同样有其表达[26]。Nakazawa等[26]对TRPV1和TRPV4在成年小鼠晶状体中表达和空间定位进行了探究,研究发现TRPV1和TRPV4在晶状体上皮、外皮质和核中均有表达,但在亚细胞水平略有不同,在上皮和外皮质中,TRPV1和TRPV4定位于细胞质中,而在晶状体核中,主要定位于纤维细胞膜上。

TRPV4在晶状体内的主要功能是感知机械和渗透压的变化。在细胞体积调节方面,当晶状体暴露于低渗环境并发生肿胀时,可通过激活TRPV4,启动信号级联,增加Na+/K+-ATP酶的活性,产生调节体积减少,恢复晶状体体积[27]。相反,高渗性晶状体收缩则通过激活TRPV1使NKCC1磷酸化,从而增加其活性并产生调节容积增加,使晶状体容积恢复到正常水平[28]。Gao等[29-30]发现在晶状体核与表面细胞之间存在着很大的静水压力梯度,这是水可以通过缝隙连接流出的基础。这种压力梯度受到一种双重反馈途径的严格调控,即利用TRPV1和TRPV4分别感知静水压力的下降或上升。当细胞受到正压力和刺激时,通过激活TRPV4进一步增加Na+/K+-ATP酶的活性;反之,则通过TRPV1抑制Na+/K+-ATP酶的活性,这种双向调控是维持晶状体透明和光学特性所必需的。

1.4TRPV4在睫状体中的表达与功能睫状体是葡萄膜的中间结构,前接虹膜根部,后以锯齿缘为界移行为脉络膜,主要包括无色素上皮、色素上皮、基质、睫状肌和睫状体上腔5个部分,主要负责房水的分泌和排出。研究表明,TRPV4在无色素上皮细胞中有功能性表达,它负责感知渗透压变化,当无色素上皮细胞水肿产生低渗效应时,PLA2途径释放花生四烯酸及其衍生物可间接激活TRPV4介导的Ca2+内流,最终介导房水生成增多[31]。褪黑素在调节昼夜节律、凋亡和氧化应激的病理生理过程中发挥着重要作用,近年研究也发现其在近视、青光眼及视网膜病变中具有潜在保护和治疗作用[32]。Alkozi等[33]发现TRPV4参与睫状体无色素上皮细胞分泌褪黑素这一过程,具体为当无色素上皮细胞上的TRPV4激活时,可激活褪黑素合成的两个关键步骤,包括:烷基胺N-乙酰转移酶(aralkylamine N-acetyltransferase, AANAT)磷酸化增加以及激活钙调素和钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ。同时,睫状肌通过调节悬韧带还可引起晶状体内静水压梯度的变化。当晶状体悬韧带完好时,睫状肌松弛增加了睫状体与晶状体之间的距离,导致细胞内静水压力下降,并可被抑制TRPV4所阻断;睫状体收缩使睫状体向晶状体方向移动,引起细胞内静水压升高和Akt磷酸化增加,并被TRPV1抑制或PI3K p110a催化亚单位基因缺失所阻断[34]。

1.5TRPV4在小梁网中的表达与功能小梁网是一种分子筛样结构,通过调节房水流出阻力维持眼内压力平衡,但其精确的液流感知机制仍不清楚。很多研究发现在人小梁网组织及Schlemm管中均有TRPV4功能性表达[35-36]。目前研究中关于TRPV4对眼内压的影响仍有争议。Ryskamp等[35]发现TRPV4通道是小梁网内机械敏感的Ca2+信号机制的关键组成部分,并且TRPV4依赖性细胞骨架重塑调节着小梁网的刚度和房水的流出,无论是系统性给药还是眼内注射TRPV4拮抗剂均可使青光眼模型小鼠眼压下降。Patel等[36]的研究表示液流或剪切力可激活小梁网上的TRPV4通道引起Ca2+内流激活内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)从而增加房水流出,敲除小梁网特异性TRPV4基因会导致小鼠眼压升高,药理性激活TRPV4通道则可以增加房水的流出从而降低眼压。Uchida等[37]发现机械刺激可激活TRPV4使小梁网前列腺素释放增加从而降低眼压。TRPV4依赖肌醇多磷酸5磷酸酶(inositol polyphosphate 5-phosphatase,OCRL)定位到小梁网初级纤毛以便正确定位和发挥功能。在正常情况下,TRPV4与OCRL相互作用可引起eNOS活性增强从而通过增加压力依赖性引流来降低眼压[38]。Yarishkin等[39]发现机械门控的花生四烯酸激活的钾离子通道-1(mechanogated and arachidonic acid-activated TWIK-related K+1,TREK-1)与TRPV4共同作为小梁网膜电位、压力敏感性、钙稳态和跨细胞渗透性的关键分子,激活TREK-1可使小梁网内Ca2+浓度增加,但这一过程可被TRPV4拮抗剂所抑制,表明小梁网的张力稳态可能是由平衡的、压力依赖的TRPV4和TREK-1机械传感器的激活共同调节。考虑到以上研究的给药方法、条件和动物年龄不同,目前关于TRPV4通道对小梁网的眼压调控尚未达成共识。

1.6TRPV4在视网膜视神经中的表达与功能视网膜由神经上皮和色素上皮组成,前界为锯齿缘,向后止于视盘,负责感知光信号并转化为电信号最终将神经冲动传递至视皮质。TRPV4在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)、Müller细胞、色素上皮以及血管内皮细胞中均有表达,参与调节细胞体积、钙稳态和存活。

细胞肿胀是引起视网膜神经细胞受损致视力损害的主要原因之一。研究发现,TRPV4是Müller细胞响应渗透变化的敏感因子,细胞肿胀激活PLA2通路,CYP450将花生四烯酸转化为5,6-EET,进而激活TRPV4通道,随后引起Ca2+释放和反应性胶质增生,抑制TRPV4有望成为抑制肿胀和水肿所致中枢神经系统小胶质细胞过度活化的靶点[40-41]。此外,TRPV4和介导血视网膜和血脑屏障液体交换的AQP4通道协同调控视网膜Müller细胞的体积和钙稳态,TRPV4依赖的Ca2+释放会激活AQP4基因表达[42]。Toft-Bertelsen等[43]还发现TRPV4本身是一个容积传感器,当细胞肿胀时可以通过膜拉伸直接激活,这种肿胀直接激活不是以PLA2活性、细胞骨架重塑和激酶活性(PKA、PKC、PKG)的方式发生的,而是以由其N端决定,其中体积变化的传感器至少部分位于最远端。在小鼠视网膜脱离模型中,Müller细胞肿胀会激活TRPV4依赖性Ca2+内流促使Müller细胞释放细胞因子MCP-1致光感受器细胞凋亡,这提示抑制TRPV4可能保护视网膜脱离患者的视力[44]。

血-视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)的破坏,会导致血管源性水肿和神经组织损伤,最终引起视力丧失。视网膜内皮细胞(retinal endothelial cells, RECs)是维持正常BRB的重要组分之一。研究发现,TRPV1和TRPV4在视网膜内皮细胞上功能性表达,体内及体外实验均证明特异性的抑制或下敲TRPV4可显著抑制内皮细胞的成管及迁移能力,这两种能力是血管生成的关键步骤。在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型中,抑制TRPV1或TRPV4任一通道均可减少视网膜新生血管形成并促进缺血的视网膜生理性再血管化[45-47]。以上这些结果表明TRPV1以及TRPV4是视网膜血管新生的调节因子,靶向这些通道可以为抑制视网膜中的病理性血管生成提供新的治疗策略,可能成为抗VEGF方法的替代或补充;同时,阻断这些通道能增强缺血视网膜的生理性血运重建,这在利用这些靶点进行治疗方面特别有利。RECs损伤致BRB通透性增加是糖尿病视网膜病变的机制之一。研究发现,在BRB的内皮和视网膜色素上皮中均有TRPV4表达,使用其选择性拮抗剂GSK2193874可以减轻糖尿病大鼠BRB的破坏;同时,研究者利用人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)单层细胞和内皮细胞系统,进一步发现:GSK2193874在糖尿病和高血糖模拟条件下似乎不参与血管抑制素对RPE所形成外屏障通透性的调节,但血管抑制素可以阻断TRPV4并维持内皮细胞所形成内屏障通透性。这一结果提示选择性TRPV4拮抗剂和血管抑制素的协同联合可以减轻糖尿病引起的BRB的破坏[48-50]。

TRPV4在RGCs、内外丛状层和双极细胞中均有表达。功能上,TRPV4通过调节Ca2+内流调节RGCs放电速率,TRPV4的持续激活会导致RGCs凋亡,抑制TRPV4可增加RGCs存活,故TRPV4可能是减轻青光眼性视力损害的潜在靶点[24,51-53]。

2展望

作为一种机体广泛表达的离子通道蛋白,TRPV4在呼吸、循环、神经、消化和泌尿等多系统多细胞病理模型中发挥着重要作用。TRPV4离子通道蛋白几乎在眼部所有组织中均有功能性表达,通过感知温度、渗透压、剪切应力等变化影响眼部各种复杂生理病理过程,如:在角膜通透性、疼痛和损伤修复;晶状体调节和白内障;房水产生、流出和青光眼;视网膜水肿调节、血管生成和屏障失调;炎症;神经退行性变等。虽然在眼科疾病相关领域TRPV4的研究取得了一些进展,但仍相对处于起步阶段,随着对TRPV4在眼科疾病发生发展中作用的认识不断深入,无论是在视网膜病变、青光眼、白内障还是角膜及眼表疾病领域,TRPV4有望成为眼病治疗的新兴靶点,为眼病的诊断与预后提供新思路。