非酒精性脂肪性肝病的系统生物学研究*

刘希敏 吴 华

1.南京中医药大学附属常州市中医医院治未病科 (江苏 常州, 213003) 2.南京中医药大学

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为我国最常见的慢性肝病,全球约有25%的成年人患有NAFLD[1],是肝脏相关疾病发病率和死亡率的最突出原因之一[2]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD中最严重的一种,其特征是甘油三酯(脂肪变性)的过度积累、炎症损伤和肝细胞凋亡,可能进展至肝硬化和肝癌[3]。目前,关于NASH/NAFLD的发病机制尚未完全阐明,诊断和治疗方法也十分有限。应用单一组学技术研究可以使人们能够更充分地理解脂肪变性和肝脏炎症相关的分子谱,这是NASH诊断中普遍接受的组织学特征,同时也是发现新的候选生物标志物的重要途径。多组学分析技术在整合多层分子信息,揭示疾病机制方面具有巨大潜力。进一步以多组学技术带来的丰富数据为基础,加上稳步增长的计算技术,形成更全面的生物学研究方法,将有助于我们系统地了解体内细胞的功能和特性,加深对NASH/NAFLD的研究。

1 NASH/NAFLD诊疗的现状和困境

1.1 NASH/NAFLD的诊断 对于NAFLD的诊断,超声仍然是一线方法[4]。而瞬态弹性成像评估控制衰减参数(CAP)是一种无创检测,允许根据肝脏硬度分级纤维化阶段[5];成像技术如磁共振(MRI)正在不断发展,磁共振成像-质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)目前可以提供NAFLD的早期诊断和预后信息,但还没能广泛使用[6,7]。这些手段共有的缺点是都不能明确区分单纯脂肪变性和脂肪性肝炎,因此肝活检仍然是诊断的“金标准”。但是由于肝活检成本高,且具有侵入性,只能针对特定的患者[8],所以迫切需要可靠、准确、非侵入性或微创的生物标志物,能够准确识别NASH。

由于NAFLD和NASH在疾病进展期之前都是无症状的,许多患者仅在进展期被发现,这就导致患者的治疗难度及成本大大提高。虽然许多无创或微创测试能够排除纤维化或肝硬化,但目前没有单一的测试来识别脂肪变性、早期诊断NASH或预测疾病进展,因此需要对早期预测因子进行研究。

1.2 NASH/NAFLD的治疗 NAFLD是一种慢性肝病,在世界范围内呈上升趋势,合并糖尿病、代谢综合征和肥胖等危险因素时会增加NAFLD的发病风险,加快其进展。NASH是NAFLD最严重的一种形式,由于肥胖和2型糖尿病的高发,预计在不久的将来会有越来越多的NASH患者[9]。截止当前,FDA还没有批准任何药物用于治疗NASH,标准治疗方法是根据体重和锻炼来改变生活方式。因此巨大的市场需求使 NASH 新药研发成为全球制药公司追逐的热点。

目前在研的新型治疗药物主要针对代谢紊乱、氧化应激、炎症、细胞凋亡、肠道微生物群紊乱及纤维化等NASH相关发病机制,并有多个针对不同靶点的新药处于临床后期研究阶段,虽然这些进展将为 NASH 提供新的治疗手段,但在早期(从基础科学到临床前阶段)和后期临床试验中,评估这么多靶点的成本是巨大的。值得注意的是,早期失败的成本占药物开发总成本的主导地位。因此,使用早期数据预测临床结果的方法对于降低开发成本至关重要。

2 组学技术助力生物标志物发现

近年来,随着高通量分子生物学技术,也就是“组学”的进步,包括基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学、脂质组学等[10],使得研究人员可以从多维度、多组学、多系统来综合揭示NASH/NAFLD发生机制、识别新生物标志物。

2.1 基因组学 高通量测序技术、微阵列、计算生物学和生物信息学的发展,导致多个全基因组关联研究(GWAS)的迅速增加,这提高了我们对NASH/NAFLD诊断和发病机制的遗传生物标志物的理解[11]。

GWAS研究为NAFLD诊断和预测中的遗传生物标志物的研究做出了重要贡献。一些研究试图建立遗传风险评分作为非侵入性遗传生物标志物。在调整了年龄、BMI、TG水平和稳态模型评估胰岛素抵抗后,发现PNPLA3、GCKR、TM6SF2和MBOAT7的多态性评分增加可预测NAFLD。迄今为止,美国国家人类基因组研究所的GWAS目录包含了24项研究,报告了100多个与NAFLD性状相关的基因变异[12],但只有少数被证实,比如PNPLA3、TM6SF2。虽然PNPLA3和TM6SF2变异的基因分型不推荐用于NAFLD的诊断,但EASL/EASD/EASO指南建议在选定的患者组中进行评估[13]。

2.2 转录组学 转录组学包括编码RNA和非编码RNA的定量评估,提供基因差异表达和基因调控机制的相关信息[11]。由于编码转录组学被认为是DNA基因信息与蛋白质图谱之间的分子桥梁,因此正在对其作为NAFLD诊断生物标志物的潜在作用进行研究。Wang等[14]发现,健康肥胖个体与伴有脂肪变性和NASH的肥胖患者之间的转录组谱存在差异,观察到超过500个差异表达基因(DEGs)。其中PRKCA、EGFR、CDC42和VEGFA是NAFLD谱系中重要的上调基因,富集途径包括FCγR介导的吞噬作用和粘附作用,这是肝脏疾病从脂肪变性向脂肪性肝炎发展的一个关键过程。

此外,受影响的肝脏产生的非编码RNA可能被用作评估疾病进展过程中可能发生的动态变化的生物标志物,作为诊断或预测标志物。非编码RNA包括small RNAs和lncRNAs,前者是由19～23个核苷酸组成的短RNA,后者是较大的分子,约为200 nt,它们在转录和转录后水平调控基因表达[15]。small RNA包括miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等,其中目前研究最多的为miRNA。miRNAs表达的改变与NAFLD有关,并与肝骨化症和NASH相关[16]。循环miRNAs正在成为NAFLD状态和进展的有潜力的无创生物标志物[16]。而miRNA中研究最广泛的是miR-122,它是NAFLD中确定的一种改变,占肝脏中所有miRNA表达的70%[16-18]。而近年来关于lncRNAs作为NAFLD潜在生物标志物作用的研究越来越多。Sun等[19]的GWAS分析在NAFLD患者中发现了1735个异常的lncRNAs。体内和患者的RNA测序研究表明,几种lncRNAs可能在发病机制中发挥关键作用。

2.3 蛋白组学 蛋白质组学是指对蛋白质组的全面分析,包括对存在于细胞、组织或有机体中的蛋白质进行鉴定和定量的技术应用[20]。与基因组或转录组相比,蛋白质组位于下游,更接近表型,因此蛋白质组分析是寻找NAFLD诊断和进展的生物标志物的首选方法[20]。然而,由于一些翻译后的修饰和剪接,蛋白质组比基因组或转录组更加复杂和动态[21],现有技术在候选蛋白质的检测和准确定量方面的限制,导致蛋白质组学研究仍然有限。

随着蛋白质组学技术和应用的发展,以及质谱(MS)和蛋白质微阵列技术的应用,使得鉴定NAFLD和非NAFLD个体之间存在差异表达的一些蛋白质的研究取得了进展。例如DDPE、ANPEP、PIGR、TGFBI和APOE已被发现与NAFLD和肝硬化相关,前三种蛋白已在体内NAFLD模型中得到验证[22]。此外,另外6个蛋白特征(SELE、IGFBP7、IGFBP5、IL-1R2、NAGK和Decorin)已被证明可以区分F3/4期和F1/2期NASH患者,具有较高的诊断准确性[23]。这些蛋白质可以作为候选的蛋白质组生物标志物。

2.4 代谢组学 代谢组学是指对存在于生物体细胞、组织和体液中的代谢组的综合研究[24]。它包括小分子和代谢产物,如氨基酸、脂肪酸和碳水化合物。考虑到代谢组学的动态特性,它只能提供特定时间、特定条件下的代谢概况的“快照”[24]。随着核磁共振波谱和质谱等高通量分析技术的使用,代谢组学研究在NAFLD和其他肝脏疾病中发现了生物标志物[24]。

在NAFLD患者中,血清代谢组学已经确定了一组以胆汁酸盐和与谷胱甘肽相关的生化物质发生显著变化为特征的生物标志物。分析这一模式,可以将健康个体与NASH或NAFLD区分开来,但不能将NASH与NAFLD患者区分开来[25]。在最近的一项旨在识别NASH中的胆汁酸代谢组的研究中,新发NASH患者餐后显示出牛磺酸和甘氨酸共轭的初级和次级胆汁酸的增加。随着NASH和肝硬化的进展,次级胆汁酸逐渐减少并逐渐耗尽[26]。

2.5 脂质组学 肝脏脂肪变性的特征是TG的产生和在肝脏中积累之间的平衡被破坏,因此脂质组学被认为是代谢组学的一个主要分支领域以识别脂质组特征,这些特征可以作为诊断NAFLD和预测疾病进展的非侵入性生物标志物[27]。

复合脂质的主要结构成分是脂肪酸,脂肪酸通过饮食引入(15%),由脂肪组织在脂肪分解过程中释放(60%)或在肝脏中通过从头脂肪生成合成(25%)[28,29]。研究表明,NAFLD患者的脂质脂肪酸组成发生改变,总饱和脂肪酸(SFAs)增加[28-30]。此外,研究表明SFAs与疾病的严重程度和NASH相关,因为SFAs的增加可导致线粒体代谢失调、促进ROS积累、内质网应激的诱导和肝脏促炎、促纤维化过程的激活。单不饱和脂肪酸(MUFAs),尤其是油酸和棕榈油酸,虽然脂毒性较小,但也参与了NAFLD的发病,因为它们在NAFLD患者和小鼠模型中均被发现升高[30,31]。甘油磷脂是细胞膜的重要组成部分,磷脂酰胆碱(PC)是一种重要的细胞膜脂类,由磷脂酰乙醇胺(PE)转化而来[30]。已发现NAFLD患者PC降低,脂质组学研究表明,NAFLD患者肝脏和红细胞PC/PE比值均降低,已被提出作为NAFLD潜在的生物标志物[32]。

3 系统生物学方法推动NASH/NAFLD诊疗进展(系统生物学方法)

3.1 多组学数据整合 基于质谱的组学技术是研究人类健康和疾病的有力工具,并有巨大的潜力来彻底改变未来的临床实验室诊断。但是,随着研究深入,人们发现单一的组学技术研究,即单纯研究某一层次生物分子变化的局限性愈发显著,已经很难满足运用系统生物学方法探讨疾病本质的要求。近年来,越来越多的研究者提出应从多分子层次出发来系统研究基因、mRNA、蛋白质和小分子间的相互作用和系统机制。这种多组学数据的整合分析已经成为表观领域的研究热点,是精准医学研究的重要发展方向。通过对多种层次和来源的高通量组学数据的整合分析,将有助于我们更加系统、深入地认识疾病的生物学本质,尤其是像NAFLD这种病理机制复杂的疾病。

将多组学技术应用于同一生物系统的优势之一是了解疾病背后的信息流,并在生物网络和分子相互作用的背景下以整体的方式解释数据,提高数据的可信度。例如一项研究采用大鼠模型,通过肝脏蛋白质组学和代谢组学分析,研究杀虫剂诱导肝脏病理的分子机制[33]。通过进行差异表达分析,然后使用通路分析工具进行功能注释,作者确定了与脂质解毒代谢过程相关的蛋白质组变化,提示脂质过氧化、氧化应激和肝细胞损伤,所有这些都是NASH样的病理特征。氧化应激和纤维化标志物代谢产物的增加进一步证实了这种与NASH样表型的关联。同样,在一项生物标志物发现的临床前研究中,对NASH大鼠模型进行了肝脏转录组学和蛋白质组学以及血浆蛋白质组学,目的是表征NASH的分子病理生理学特征,并识别新的血浆生物标志物[34]。通过收集与NASH发病机制相关的分子信号,将多组学数据与肝脏组织学特征和先验知识相结合,可以捕获病变肝脏RNA水平的分子变化到肝脏和血浆蛋白质水平变化的翻译,并提高了发现的潜在非侵入性生物标志物的生物学分辨率。

3.2 基因组代谢网络模型/整合网络(GEMs/INs)的运用 由于NASH疾病病理生理学复杂,并且随着组学技术的发展,生物标记物和治疗靶点的发现越来越丰富,使用传统方法评估这些目标显然变得十分困难。而使用系统生物学技术可以有效地分析组学等临床数据,提供科学的见解,指导靶点的选择和评价。系统生物学是利用计算技术来分析和建模一个生物系统的组件如何相互作用来产生系统的特性和行为。最近几十年,计算机处理能力稳步增长。计算能力的增强,加上新“组学”技术带来的越来越丰富的数据,导致了一种更全面生物学研究方法,被称为“组学”革命。为了了解体内细胞的功能和特性,系统生物学分析使用基因组学考虑整个生理系统,转录组学、蛋白质组学、代谢组学等数据来揭示它们之间的相互关系,并解释特性。得到的模型可以用于集成各种相关的、但异构的数据,不仅可以理解系统,还可以对尚未进行的实验和试验进行定量预测。

GEMs和INs建模提供了一种方法可以集成和利用大量异构数据以提供预测模型。GEMs是基于微生物基因组信息、转录组学、蛋白组学网络构建的底盘细胞水平的代谢网络模型。其收集了生化反应和相关基因,以及多组学数据预测通量。其已被用于更深入地了解疾病生物学,整合细胞、生理和临床数据,揭示代谢相关疾病的潜在分子机制[35,36],如急性营养不良中的人类发育。通过整合脂质代谢的广泛描述,Mardinoglu等[37]重构了肝细胞GEM,该GEM为NASH患者的基因型-表型关系提供了更深入的组学数据。基于转录组学数据,系统级分析还提供了NASH潜在分子机制的详细信息。作者提出了潜在的生物标志物,并表明血液中软骨素和硫酸肝素的浓度适合于诊断NASH和NAFLD的分期。近年来,人们将GEMs与蛋白质互作网络(PPINs)和转录调控网络(TRNs)相结合,并生成整合网络(INs)来研究疾病状态的全球生物学差异[35]。GEMs/INs能够利用一系列不同的数据类型,如来自只有少数受试者的Ⅰ期临床试验的数据,或来自早期开发的体外或者动物数据,以找到更好的靶点,并评估这些靶点来预测临床疗效。例如,使用肝脏中适当的RNA测序数据,我们可以推断出成千上万的肝脏通量变化。Lee等[35]应用了一系列综合的技术来促进ENCODE数据库整合到一个有意义的肝细胞、肌细胞和脂肪细胞模型中,使他们能够识别甘露糖作为糖尿病胰岛素抵抗的标志。该工作利用综合路径数据,使用GEMs、TRN和PPIN分析生成IN模型。基于IN的预测是通过使用来自1 000多名患者的临床数据,以及相关的统计分析和检验来验证的。虽然该研究中的IN分析仅与Ⅱ型糖尿病和代谢研究相关,但它预示着更广泛的应用,例如在慢性肝病、肿瘤和免疫疾病中。

4 结论

基于质谱的组学技术是研究人类健康和疾病的有力工具,并有巨大的潜力来彻底改变未来的临床诊断手段。虽然早期研究显示,基础科学发现转化为临床应用的概率极低,但随着临床组学大规模地分析患者样本,基于计算机的算法在大型临床研究中的运用,肝病生物标志物的识别与验证取得突破性发展。展望未来,随着基于质谱的设备用于临床,将有更多的诊断方法与治疗手段亟待验证,从而推动NASH/NAFLD的研究进展。