碱解法优化可溶性羽毛肽工艺研究*

吴承燕，何爱明，张焦南，胡兵，陈文韬*

（1.福建技术师范学院，福建 福清 350300；2.福建省特种水产配合饲料重点实验室，福建 福清 350300）

我国家禽养殖业规模迅速扩大，废弃羽毛数量也随之增加[1]。禽类羽毛往往由富含二硫键的角蛋白组成，蛋白含量高达85%～90%，但是羽毛韧性高且机械强度大，表面覆盖脂质降低了角蛋白的亲水性，很难被常见的蛋白酶水解[2,3]。羽毛直接丢弃填埋也很难被土壤微生物分解，同时会对水体、空气等环境造成污染，甚至滋生有害细菌及病毒，危及人体健康[4]。作为家禽加工的副产品，羽毛资源的开发利用具有较高的经济价值，前景广阔，可以作为新型的食品原辅料应用到食品加工行业中，对促进经济的发展和环境的保护都具有很大的意义。

常用的羽毛肽提取方法包括酸解法、碱解法及酶解法，一般均需先破碎形成羽毛浆，之后制备羽毛粉，步骤繁琐[5-7]。本研究利用碱解法制备可溶性羽毛肽，先将废弃鸡羽毛蓬松打碎，增大与提取液直接接触面积，并通过单因素及正交实验，探究氢氧化钠溶液质量分数、水解时间、水解温度、料液比对提取率的影响，以期为废弃鸡羽毛的高值化应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡羽毛：市售；氢氧化钠、茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；浓盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（BS224S）：北京赛多利斯仪器系统有限公司；数显恒温水浴锅（HH-2）：国华电器有限公司；紫外分光光度计（UV754N）：上海佑科仪器仪表有限公司；精密pH计（PHS-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司；万能高速粉碎机（DE-400）：浙江红景天工贸有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-GF101-3-BS-Ⅱ）：上海跃进理疗机械有限公司；电子调温万用电炉（DK-98-Ⅱ）：天津市泰斯特仪器有限公司；凯氏定氮仪（K8940）：济南海能仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 羽毛肽的制备与测定

预处理：将鸡羽毛洗净，于45 ℃下烘干，放入粉碎机粉碎，收集蓬松的羽毛绒，置于干燥处备用。

氨基酸标准曲线的绘制：将0.2000 g赖氨酸溶于去离子水中，定容至100.00 mL。吸取10.00 mL赖氨酸溶液稀释至100.00 mL，得200 μg/mL的氨基酸标准溶液。分别吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL氨基酸标准溶液，各加入茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液1 mL，混合均匀后置于沸水浴中加热15 min，取出后置于冷水中降至室温，定容至25.00 mL，静置15 min后在570 nm下测定吸光度值。以所含氨基酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线如图1所示。

图1 氨基酸含量标准曲线

羽毛肽制备与测定：取羽毛绒置于一定量氢氧化钠溶液中，加热碱解，碱解液旋蒸2 h后得浓缩碱解液。取10 mL浓缩碱解液加入50 mL去离子水及5 g活性炭脱色，加热至沸并保持30 s。过滤后滤液用水定容至100.00 mL。加入茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液各1 mL，混合均匀后置于沸水浴中加热15 min，冷至室温，定容至25.00 mL，静置15 min后在570 nm下测定吸光度值。利用茚三酮测量氨基酸法鸡羽毛水解液中的氨基酸含量, 计算公式如式⑴所示。

式⑴中，c为氨基酸标准曲线上查的的氨基酸含量，μg/mL；K为样品稀释倍数；V为测定时取样体积，mL。

1.3.2 单因素实验

分别选取氢氧化钠溶液质量分数（2%、4%、6%、8%、10%）、料液比（1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶14）、水解时间（2、4、6、8、10 h）、水解温度（50、60、70、80、90 ℃）进行单因素实验。水解后将pH值调至6.8～7.2，考查各因素对羽毛肽制备的影响。每组实验设置3个平行。

1.3.3 正交试验

在单因素实验的基础上，设置水解温度(A)、水解时间(B)、氢氧化钠溶液质量分数(C)和料液比(D)为主要影响因子，每个影响因素各取3个水平进行L9(34)正交试验，试验因素水平如表1所示。

表1 水解因素水平表

1.3.4 数据处理

采用Origin和SPSS软件对数据进行绘图和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 氢氧化钠溶液质量分数对羽毛水解的影响

氢氧化钠溶液质量分数对羽毛水解的影响如图2所示。由图2可知，羽毛水解后的氨基酸含量随氢氧化钠溶液质量分数呈现先上升后下降的趋势，这是因为氢氧化钠溶液质量分数较低时水解不完全，过高时则会破坏氨基酸结构，为4%时氨基酸含量最高，表明此时水解程度最大，因此水解羽毛的较佳氢氧化钠溶液的质量分数为4%。

图2 氢氧化钠溶液质量分数对羽毛水解的影响

2.1.2 料液比对羽毛水解的影响

料液比对羽毛水解的影响如图3所示。由图3可知，随着料液比的降低，水解羽毛所得的氨基酸含量呈快速上升趋势，在料液比为1∶12时达到最大值。这是因为随着液体体积的增加，羽毛与氢氧化钠接触碰撞的机会降低，从而减慢反应速率，且体积的增大增加了处理成本。综合考虑水解羽毛的较佳料液比为1∶12。

图3 料液比对羽毛水解的影响

2.1.3 时间对羽毛水解的影响

时间对羽毛水解的影响如图4所示。由图4可知，前8 h羽毛水解出的氨基酸含量不断升高，且反应速率较快，但8 h后水解速率增加放缓，可能是因为8 h时羽毛与氢氧化钠添加量之间达到平衡。因此水解羽毛的较佳时间为8 h。

图4 时间对羽毛水解的影响

2.1.4 温度对羽毛水解的影响

温度对羽毛水解的影响如图5所示。由图5可知，随着温度的升高，羽毛水解出的氨基酸含量也随之增多。在低于70 ℃时，水解速率较快，这是因为升温可提升羽毛与氢氧化钠之间的碰撞频率，在温度高于70 ℃后，水解速率增加明显放缓，因此水解羽毛的较佳温度为70 ℃。

图5 温度对羽毛水解的影响

2.2 正交试验结果分析

正交试验结果如表2所示。由表2可知，以氨基酸含量为评价指标，最佳水解工艺为A3B3C3D2，即氢氧化钠溶液质量分数为5%、料液比1∶12、水解时间9 h、水解温度75 ℃。由表2数据进行方差分析，结果如表3所示，A、B、C、D均有显著意义。按优选出的条件进行验证试验，平行3组，测得氨基酸含量分别为949.91、948.98及952.22 μg/g，平均含量为950.37 μg/g，RSD为0.18%，验证中氨基酸含量均高于正交最高，具有较好重现性，表明此水解工艺条件稳定可行。

表2 羽毛水解工艺正交试验设计表及结果

表3 多因素方差分析表

3 结论

本实验以羽毛为原料，通过酶解法制备羽毛肽，通过单因素实验及正交试验对氢氧化钠溶液质量分数、料液比、水解时间和水解温度这4个因子进行优化，得到最佳工艺条件：氢氧化钠溶液质量分数5%、料液比1∶12、水解时间9 h、水解温度75 ℃。按最佳水解工艺进行验证试验，稳定性好，证明了该水解工艺的可行性，适合工业化大生产。