中药活性成分通过调节m6A 甲基化修饰抗肿瘤的研究进展

2024-03-22王梦斐蒲位凌于海洋

中草药 2024年6期

韩笑，王梦斐，蒲位凌，刘博，于海洋*

1.天津中医药大学组分中药国家重点实验室天津 301617

2.四川大学生物治疗国家重点实验室四川成都 610041

随着医学的进步和对肿瘤认识的加深，肿瘤治疗可以选用多种不同的方式，包括放疗、化疗、手术和免疫治疗等。目前癌症治疗中手术仍不失为一线治疗方案，但癌症手术治疗存在风险性，尤其是对于部位敏感的肿瘤，如脑肿瘤，手术危险性大，成功率低。另外，癌症手术对人体创伤大，使患者免疫力降低，对疾病抵抗能力下降，术后易产生一系列手术并发症。此外，化疗和放疗治疗后易引起患者抑郁、食欲不振等副作用的发生。近年来，来自传统中药（traditional Chinese medicine，TCM）中活性成分在肿瘤治疗中的潜力已被西方国家所认可。已有多种天然产物及其衍生物被纳入癌症化疗的标准库，例如长春花生物碱、紫杉醇和喜树碱等[1]。目前，传统中药对肿瘤的治疗效果得到证实，但其治疗癌症的机制仍有许多尚不明确，限制了其临床使用。因此，作为癌症的新型或替代疗法需对其作用机制进行深入研究[2]。

表观遗传学是指在不改变DNA 序列的基础上调节基因发生可遗传变化的一门学科，包括DNA 甲基化、RNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA 调控等[3-6]。其中，DNA 和RNA 的甲基化修饰普遍影响多种疾病进程，在近期研究中被广泛关注[7]。N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是迄今为止最普遍最丰富的RNA 甲基化修饰，是指RNA腺苷酸的第6 位氮被甲基化，随着特异性抗体的研发及高通量测序的快速发展，几乎所有类型的RNA上均发现m6A 修饰[8]。1997 年第1 个m6A 甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）的成功克隆[9]以及2011 年第1 个m6A 去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）的确定，表明m6A 甲基化修饰是动态可逆的，这为表观遗传学的研究注入了新的生机[10]。已有研究表明，m6A 修饰相关蛋白及m6A修饰的失调在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用。本文旨在介绍m6A 修饰相关蛋白的分类及功能，并总结中药活性成分通过调节m6A 甲基化修饰发挥抗肿瘤作用的研究进展。

1 m6A 甲基化酶的分类及功能

1.1 m6A 甲基转移酶

甲基化转移酶（methyltransferase）也称“Writers”，是指催化 RNA 上的特定碱基序列（RRACH，其中R = G/A，H = A/C/U）发生m6A甲基化修饰的酶。由核心蛋白METTL3、METTL14、WTAP、RBM15、RBM15B、HAKAI、VIRMA（KIAA1429）和ZC3H13 组成的甲基转移酶复合物催化[11]。METTL3 和METTL14 在核斑点中共定位形成异二聚体复合物（MTC）。其中METTL3 是通过S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作为甲基供体催化甲基化的发生，选择性诱导RNA的GAC 和AAC 碱基序列发生甲基化。越来越多的研究表明，METTL3 参与肿瘤的生长、侵袭、迁移等多个方面[12]。例如，METTL3 可通过m6A/YTHDF2 依赖的方式抑制肝细胞癌中细胞因子信号传导抑制因子 2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）的表达，使其在功能上被沉默，从而促进HCC 细胞的增殖与迁移[13]；METTL3 还可通过调节靶基因和通路介导结直肠癌的发生发展，从而引发结直肠癌细胞的自我更新、增殖和迁移等[14]。与METTL3 相比，METTL14 在大多数的癌种中起到抑癌作用，包括肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、胃癌、结直肠癌等[15]。功能上METTL14 选择性诱导RNA 的GAC碱基序列甲基化[16]。除此之外，其他蛋白缺乏RNA甲基化酶活性。WTAP 作为m6A 甲基转移酶的调节亚基，与METTL3 和METTL14 相互作用并将其募集到核斑点[17]。最近的研究表明，WTAP 的异常表达与癌症中的多种现象密切相关，包括细胞周期、代谢、自噬、免疫、铁死亡、上皮间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）和耐药性等[18]。RBM15 和RBM15B 结合METTL3 和WTAP，并将其精准定向到m6A 修饰后的RNA 位点上[19]，目前已在多项肿瘤研究中检测到RBM15的异常突变，包括间质性甲状腺癌[20]、急性髓系白血病[21]及肺癌[22]等。VIRMA 通过募集MTC 来调节区域选择性甲基化的发生，主要在3’UTR 和终止密码子附近介导m6A 修饰[23]，VIRMA 以m6A 依赖的方式，通过靶向DNA 结合抑制因子2（inhibitor of DNA binding 2，ID2）、GATA 结合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）等调节不同通路发挥促癌作用[24]。ZC3H13、WTAP 及CBLL1等多种辅助因子的共同作用，可有效地调控核内m6A 甲基化修饰[19,23]。此外，最近研究人员提出，存在独立的RNA 甲基转移酶METTL16，可调控细胞内SAM水平并参与U6核内小RNA（small nuclear RNA，snRNA）中的m6A 修饰[25]。

1.2 m6A 去甲基化酶

去甲基化酶（demethylases）也称“Erasers”，m6A去甲基化酶FTO[10]及alkB同系物5（ALKBH5）的发现，表明m6A 修饰过程的可逆性。ALKBH5 与FTO 均为Alkb 家族的同源蛋白，以α-酮戊二酸和二价铁离子依赖的方式催化m6A 修饰的腺苷去甲基化[26]，FTO 或ALKBH5 的表达与细胞中的m6A整体含量密切相关。其去甲基化的过程大致为氧化m6A 形成N6- 羟甲基腺苷（N6-hydroxymethyladenosine，hm6A），然后将hm6A 转化为中间体N6-甲酰腺苷（N6-formyladenosine，f6A），最后f6A 水解为腺苷（A）。FTO 主要表达在大脑，可以调节脂肪产生和机体能量稳态[27]。FTO 在癌症中的作用在黑色素瘤中首次得到证实[28]。除此之外，FTO在不同癌种中功能及对肿瘤进展的影响也相继被证实。ALKBH5 在睾丸中的表达最高，在心脏和大脑中的表达相对较低，主要影响核RNA 的转运及基因表达[29]。研究表明ALKBH5 可通过调节FOXM1 的表达，增强了胶质母细胞瘤干细胞的自我更新和增殖，并促进肿瘤的发生[30]。此外，ALKBH5 是多种癌症的预后指标，其可以调节肿瘤生物过程，如细胞增殖、侵袭、迁移、转移和肿瘤微环境等[31]。最近的研究确定了另一种m6A 去甲基化酶AlkB 同系物3（ALKBH3），且发现其多选择性介导tRNA 而非mRNA 或rRNA 中的m6A 修饰，同样可以通过上述机制完成去甲基化过程[32]。

1.3 m6A 甲基化阅读蛋白

甲基化阅读蛋白（RNA N6-methyladenosine reader）又称“Readers”。m6A 阅读蛋白可以通过识别并结合甲基转移酶修饰的RNA 序列来调节该基因的表达，进而影响其下游生物学功能。不同的阅读蛋白具有不同的m6A 定位功能，包括YTH 结构域蛋白家族 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和YTHDC2，其具有保守的m6A 结合结构域，可以与含有m6A 修饰的RNA 结合[33]。其中，YTHDC1 位于细胞核，主要参与编码RNA 的剪接和非编码RNA 介导的基因沉默，影响RNA 出核等功能[34]，其在癌细胞增殖、血管生成、转移等多种细胞功能中至关重要[35]。其他4 个蛋白均在细胞质中发挥功能，YTHDC2 结合于甲基化修饰的mRNA序列上提高其翻译效率[36]，在肿瘤发生发展中YTHDC2 是诱导恶性表型的蛋白质翻译所必需的。YTHDF1 与终止密码子周围的m6A 位点结合，提高被修饰RNA 的翻译效率[37]；YTHDF2 能够特异性识别经m6A 修饰的mRNA，招募相应的酶破坏靶RNA 稳定性、促进其降解[38]；YTHDF3 既可与YTHDF1 协同作用促进靶RNA 翻译，同时还可以通过直接与YTHDF2 相互作用来加速mRNA 降解[39]。YTHDF 蛋白可以作为致癌因子促进癌症的发生发展，同时也可以作为肿瘤抑制因子来抑制某些癌症发生[40]。除了YTH 结构域家族的成员外，还有其他的m6A 甲基化阅读蛋白，包括核内不均一性核糖核蛋白（HNRNP）家族成员HNRNPA2/B1、HNRNPC 和HNRNPG，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP）家族成员IGF2BP1/2/3 以及真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）。HNRNPA2/B1 可以识别前体 microRNA（primiRNA）上的m6A 修饰位点，促进pri-miRNA 加工[41]；HNRNPC 和HNRNPG 在识别m6A 后可通过调节mRNA 丰度和剪接进而影响RNA 的二级结构[42]。IGF2BP1/2/3 可识别并以m6A 依赖方式促进mRNA 稳定性和翻译并参与mRNA 的剪切[43]。elF3在甲基化修饰过程中可与YTHDF1 相互作用，与RNA 5’UTR 上被修饰的碱基序列结合促进mRNA的翻译[44]。由于不同组织的肿瘤基因表达谱有一定差异，m6A 修饰相关蛋白在不同肿瘤中的作用和机制也大不相同。近年来的研究表明，m6A 修饰在肿瘤发生发展中起着关键作用，m6A 修饰相关蛋白已被验证为多种癌症的潜在生物标志物。以调控肿瘤中RNA 的m6A 修饰水平为靶点，研发天然、低毒及高效的靶向抗肿瘤药物，可能为肿瘤的预防和治疗提供新的研究方向。

2 中药活性成分通过调节m6A 甲基化修饰发挥抗肿瘤的作用

2.1 中药活性成分通过调节m6A 甲基转移酶抗肿瘤

METTL3 作为m6A 甲基转移酶，通过与SAM结合将甲基基团转移到被修饰的RNA 上形成甲基化RNA。已有研究表明METTL3 在不同类型的癌症中表达水平各异且发挥不同的功能。金雀异黄酮可通过直接抑制METTL3 的表达影响其催化活性，进而下调整合素 Β1（integrin beta-1，ITGB1）mRNA 上m6A 水平，抑制ITGB1 表达，进而在抑制细胞迁移、侵袭等过程中发挥作用，达到抑制肺腺癌进展的目的[45]；槲皮素作为一种多功能抗氧化剂，可降低心血管疾病、代谢紊乱和各种癌症带来的危害[46]，现有研究表明槲皮素可通过下调基质金属蛋白酶 2 （ matrix metalloproteinase-2，MMP2）、埃兹蛋白（Ezrin）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和METTL3 表达增强宫颈癌细胞的化学敏感性进而达到加强顺铂抗肿瘤作用的目的，最终促进宫颈癌细胞凋亡[47]；此外，虚拟筛选研究结果表明槲皮素可以与METTL3蛋白结合，形成稳定的蛋白质-配体复合物，作为METTL3 抑制剂抑制肿瘤细胞增殖[48]。龙血竭作为一种传统草药，传统用于治疗心血管、胃肠道、妇科等疾病，近年在癌症研究中取得一定的进展。研究表明龙血竭乙醇提取物能通过下调METTL3 表达并降低METTL3 和凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）家族的成员生存素（survivin）mRNA的结合，来降低survivin mRNA 中的m6A 修饰以减少其表达，最终通过促进细胞凋亡发挥抗肝癌作用，且龙血竭能有效抑制裸鼠肝癌异种移植的生长，呈现出毒性低，不良反应小的特点[49]。黄芩苷是一种黄酮类化合物，主要来源于黄芩。研究表明黄芩苷通过作用于METTL3，下调己糖激酶结构域蛋白1（hexokinase domain component 1，HKDC1）的甲基化含量使 HKDC1 表达下调，最终通过影响HKDC1/JAK2/STAT1/caspase-3 通路诱导肝细胞凋亡，抑制2 型糖尿病诱发的肝癌发生发展，这为黄芩苷用于预防和治疗二型糖尿病诱导的肝癌临床应用提供了理论依据[50]。

METTL14 作为“Writers”的另一重要成员，是许多癌症的肿瘤抑制因子，包括结直肠癌[51]，膀胱癌[52]和乳腺癌[53]等。异丹叶大黄素（isorhapontigenin，ISO）是从少苞买麻藤中提取得来，被证明具有抗癌特性。研究发现ISO 可通过下调波形蛋白（vimentin，Vim）的表达来抑制膀胱癌细胞的侵袭，作用机制为ISO 处理后上调转录因子FOXO3a 的表达并激活METTL14，METTL14 下调EMT 家族中的关键成员Vim 的表达进而抑制膀胱癌细胞的侵袭[54]。Delicaflavone（DLL）是主要来源于中药石上柏的双黄酮类化合物，研究表明其具有抗肿瘤活性。最新研究表明DLL 通过抑制肺癌细胞中的METTL3 和METTL14 来上调STAT1 和干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）的表达以及细胞因子的分泌，激活抗肿瘤免疫来抑制肺癌细胞生长[55]。

2.2 中药活性成分通过调节m6A 去甲基化酶抗肿瘤

FTO 作为一种m6A 去甲基转移酶，最初发现在肥胖相关疾病中发挥作用，近年研究表明FTO 也以m6A 依赖的方式影响肿瘤的发展，且在多数癌种中均表达升高[56-57]。研究发现，温郁金提取物榄香烯对结直肠癌5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）耐药性有一定程度的改善作用，实验结果表明FTO通过p53/GPX4 通路调控铁死亡，并参与β-榄香烯逆转结直肠癌5-FU 耐药的过程[58]。FTO 作为关键蛋白在白血病的发生以及白血病细胞分化中同样起着重要作用[59]，天然的蒽醌衍生物大黄酸，作为FTO 的抑制剂可以降低其细胞内FTO 蛋白的表达水平，诱导M3 型急性髓系白血病细胞HL-60、NB4及急性淋巴细胞Nalm6 发生凋亡[60]。槟榔碱是槟榔中的主要活性生物碱，是口腔黏膜下纤维化和口腔癌发展的强效致癌物，研究表明这可能与槟榔碱上调FTO 的表达促进体内外口腔癌细胞的增殖与迁移能力有关[61]。从柴胡中提取的一种三萜皂苷化合物柴胡皂苷-D 可通过直接靶向FTO，参与FTO介导的m6A 甲基化修饰调控其下游靶标MYC、CEBPA、ASB2、RARA 的表达抑制白血病细胞增殖[62]。另有研究表明，中药黄连中提取的异喹啉类生物碱小檗碱，可通过降低FTO 负调节因子β 连环蛋白的表达而上调FTO 的蛋白表达水平，降低m6A 的总RNA 修饰达到调节肿瘤干细胞干性的目的，该研究结果表明小檗碱可能作为一种新型m6A 甲基化调节剂在结肠癌的治疗中发挥作用[63]。赖巍巍等[64]秉持着“老药新机制”的原则从表观遗传调控方面揭示黄芩苷抗肿瘤效应的表观干预机制，发现黄芩苷能够上调m6A 甲基转移酶METTL3 和METTL14 的表达且下调去甲基转移酶FTO 和ALKBH5 的表达，上调m6A 甲基化修饰进而调控Suv39H1基因的选择性剪切发挥抗鼻咽癌的作用。

2.3 中药活性成分通过调节m6A 甲基化阅读蛋白发挥抗肿瘤作用

m6A 甲基化阅读蛋白主要功能为识别并结合甲基转移酶修饰后RNA 的m6A 位点，进而决定靶RNA 的不同去向及生物学功能。最近研究表明，漆黄素可通过下调甲基转移酶ZC3H13 的表达，降低参与DNA 损伤的PHD 指蛋白10（PHD finger protein 10，PHF10）的m6A 修饰，使YTHDF1 识别修饰后的PHF10 并稳定其表达的功能被抑制，诱导DNA 损伤进而发挥抗胰腺癌的作用[65]。白藜芦醇作为一种含芪类结构的多酚类非黄酮天然活性物质，来源广泛且具有多种生物学功能。研究表明白藜芦醇可通过降低YTHDF2 表达水平和m6A整体含量进而调控人肝癌细胞HepG2 的脂质代谢和能量代谢，抑制肝癌细胞的增殖能力[66]。中药雷公藤中存在的一种重要的天然生物活性物质雷公藤红素，可通过下调胰腺癌细胞中的METTL3 而降低细胞中总体RNA m6A 修饰水平，尤其是下调扣环基因（claspin，CLSPN）和B 细胞淋巴瘤-2（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）的mRNA m6A 的修饰水平；同时可通过下调细胞中YTHDF3，降低Claspin和Bcl-2的mRNA 的稳定性而影响其表达水平，抑制胰腺癌细胞的增殖和细胞周期进程、促进细胞凋亡[67]。人参皂苷Rh2是红参中特有的皂苷成分，具有广泛的抗肿瘤效果，研究表明人参皂苷Rh2可通过下调驱动蛋白家族成员KIF26B（kinesin family member 26B，KIF26B）表达进而影响甲基转移酶ZC3H13/CBLL1 的核定位，降低其对致癌因子SRF的m6A 修饰，使m6A 甲基化阅读蛋白IGFBP1 与m6A 修饰后SRF mRNA 上3’UTR 结合减少，最终通过破坏SRF 的稳定性、减少其表达达到抑制肿瘤细胞生长的目的[68]；此外，黄连中黄连碱被证明可通过促进IGF2BP1 泛素化抑制肝细胞癌增殖和转移[69]。钩吻中主要毒性成分胡蔓藤碱乙，可显著下调m6A 识别蛋白IGF2BP3 的表达，导致其靶向的细胞骨架、紧密连接和粘附连接相关基因的存储、翻译和降解发生紊乱，揭示了胡蔓藤碱乙诱导人结肠癌细胞HCT116 细胞毒性的潜在分子机制[70]。

3 结语与展望

m6A 甲基化作为最普遍的RNA 修饰在肿瘤发展中具有两面性，某些基因的m6A 修饰增多可能调节该基因的表达水平、介导其功能的改变进而影响肿瘤发展，而一些基因缺乏m6A 修饰也可能促进或抑制肿瘤的发展。同时m6A 修饰相关蛋白作为多种生理过程和疾病进展的关键蛋白，在肿瘤的发展中同样发挥着重要作用。总之，m6A RNA 甲基化研究方法的快速发展及m6A 与癌症之间机制的深入挖掘有助于揭示癌症发展的潜在机制[71]。

中药是自然界的馈赠，与化学药物的临床治疗疗效相比，这些来自草药的活性成分在具有疗效的基础上拥有相对较低的毒性。有证据表明，中医药联合化疗或放疗能够在增强其疗效的同时减少由放、化疗引起的不良反应。已有大量研究阐明了中药在癌症治疗中的作用机制[72]。本文综述了m6A 修饰相关蛋白的分类和功能，以及中药有效成分如金雀异黄酮、槲皮素、龙血竭提取物、黄芩苷、白藜芦醇、人参皂苷Rh2等直接调节m6A 修饰相关蛋白或以m6A 依赖的方式调节相关通路发挥抗肿瘤作用的研究进展（表1、图1）。本文旨在更清楚地阐述中药活性成分用于癌症治疗的分子机制，为拓宽中药应用范围、开发其抗癌潜力，以及为传统中药临床转化提供理论基础。为挖掘更多的中药活性成分及其抗癌的潜在机制提供思路。