黄芩苷通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻脂多糖诱导的心肌细胞凋亡

苏大为 刘玲 杨志龙

(1.兰州市第一人民医院心血管内科,甘肃 兰州 730050;2.甘肃省中心医院心血管内科,甘肃 兰州 730080;3.兰州市第一人民医院健康管理中心,甘肃 兰州 730050)

心力衰竭是各种心脏疾病终末阶段所表现出来的一种综合征,具有高患病率、致残率及死亡率,且病情复杂,预后差,是威胁人类健康的重大疾病之一[1]。目前治疗心力衰竭的主要手段是药物治疗,西药以利尿剂、强心剂、扩血管剂等为主,但往往由于心力衰竭合并症多且病情反复、药物耐受性不良等因素影响疗效[2]。中医学认为心衰总病机是“气虚血瘀水停”,治疗总原则以益气活血利水为法[3]。中药提取物黄芩苷是从黄芩中提取的一种酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用。近年来已发现,在各种心血管疾病治疗中表现出免疫调节、抗炎以及保护心肌细胞等作用[4],例如,黄芩苷可对心脏骤停后缺血性心肌损伤提供心脏保护[5],对心肌衰竭大鼠心律失常、心室重构、凋亡起保护作用[6]。目前,虽有较多文献证实黄芩苷对心肌细胞损伤有保护作用,但具体的作用机制尚不清楚。Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路是重要的细胞内信号转导通路家族,可参与调节细胞多种生物学特性及炎性反应等。研究表明,JAK2/STAT3信号通路参与调控心肌炎心肌损伤的发展[7],在脑缺血再灌注损伤炎性反应中也发挥重要作用[8]。但黄芩苷对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的心肌细胞增殖、凋亡的影响及对JAK2/STAT3信号通路作用尚未可知。基于此,进行了本研究实验,旨在为心肌损伤的体外研究提供新的理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、药品与试剂 大鼠心肌细胞(H9C2)购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。胎牛血清(FBS)(货号:10270-106)、DMEM培养基(货号:12100)购自美国Gibco公司,黄芩苷(货号:B20570)、LPS(货号:S11060-10mg)、JAK2/STAT3通路抑制剂AG490(货号:S31521)、JAK2/STAT3通路激活剂colivelin(货号:867021-83-8)购自上海源叶生物科技有限公司,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒(货号:ST067)购自上海碧云天生物技术有限公司,Hochest 33258染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司,活细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(货号:40203ES80)购自上海翌圣生物有限公司,逆转录试剂盒(货号:R312-02)、SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(货号:Q711-02)购自杭州主诺生物技术有限公司,RIPA裂解液(货号:R0010)购自北京索莱宝公司,BCA蛋白试剂盒(货号:ab207001)购自英国Abcam公司,鼠抗人[JAK2(货号:SAB4501601,稀释比例:1∶1 000)购自Sigma公司、STAT3(货号:TA347058,稀释比例:1∶5 000)购自北京中杉金桥公司、p-JAK2(货号:WL02997,稀释比例:1∶500)购自万类生物科技有限公司、p-STAT3(货号:sc-8059,稀释比例:1∶1 000)购自SantaCruz公司、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)(货号:66470-2-Ig,稀释比例:1∶3 000)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(货号:60186-1-Ig,稀释比例:1∶5 000)及β-actin一抗(货号:66009-1-Ig,稀释比例:1∶5 000)购自武汉三鹰生物有限公司]、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(二抗)(货号:ab6789,稀释比例:1∶5 000)购自英国Abcam公司。DM1000型倒置荧光显微镜(德国Leica公司),MCO18AIC型二氧化碳培养箱(日本三洋电机公司),7Champ Gd5000型凝胶成像系统(杭州赛智科技有限公司),500型实时荧光定量PCR仪器(美国ABI公司),酶标仪(Multiskan FC,美国Thermo公司)等。

1.2 方法

1.2.1 H9C2细胞培养 心肌细胞株H9C2接种于含10% FBS的DMEM培养基中,并置于70%～80%湿度,5% CO2,37 ℃培养箱中培养,隔2～3 d更换一次培养液,生长密度达>80%时传代,达到对数期生长时用于实验。

1.2.2 分组与干预 将心肌细胞分为对照组、LPS组和LPS+5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组。对照组细胞不做干预,LPS组以1 μg/mL LPS刺激24 h构建体外炎症模型,LPS+5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组在LPS组的基础上加入5、10、20、40 μmol/L黄芩苷。筛选出最适浓度黄芩苷后,再次分组:对照组、LPS组、LPS+10 μmol/L黄芩苷组、LPS+AG490组、LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组和LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组。LPS+AG490组是在LPS组的基础上,加入20 μmol/L AG490,LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组在LPS组的基础上,加入10 μmol/L黄芩苷,同时加入20 μmol/L AG490,LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组在LPS组的基础上,加入10 μmol/L黄芩苷,同时加入0.5 μmol/L colivelin,复孔为3个,培养箱培养(37 ℃,5% CO2)。

1.2.3 酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定H9C2细胞因子表达情况 细胞分组方法同1.2.2,干预24 h的细胞,取各组细胞上清液,分别遵循白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒说明书操作步骤,测定细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平。

1.2.4 CCK-8法测定H9C2细胞活力 取干预24和48 h的各组细胞,加入10 μL CCK-8溶液培养,2 h后使用酶标仪测450 nm处各孔的吸光度值,计算细胞活力。细胞活力(%)=(LPS组或5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.5 EdU法测定H9C2细胞增殖率 各组细胞EdU处理:去除培养液后4%多聚甲醛固定(0.5 mL,室温15 min),BSA洗涤(0.5 mL 3%,3次);TritonX-100去除BSA(0.5 mL 0.3% )后室温10 min,BSA洗涤(3次);加200 μL Click反应液(现配现用,12孔板),室温孵育30 min(避光)后去除Click反应液;每孔加入0.5 mL Hoechst(室温孵育10 min),去除Hoechst;拍照(荧光显微镜,Zen处理图片)。细胞增殖率(%)=(红光细胞/蓝光细胞)×100%。

1.2.6 Hochest 33258染色法测定H9C2细胞的凋亡情况 取各组干预24 h的细胞,PBS洗涤细胞2次(每次5 min),加入新鲜配置4%多聚甲醛,4 ℃固定10 min。PBS洗涤细胞3次(每次5 min),Hochest 33258染色液(5 mg/L)染色10 min,PBS洗涤细胞3次(每次5 min),封固后荧光显微镜观察、随机选择3个视野拍照,分析细胞凋亡情况。细胞凋亡特征为核体积浓缩变小,染色不均浓染且所发荧光较强,呈亮蓝色。细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.2.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定H9C2细胞中Cyclin D1、Caspase-3 信使RNA相对表达量 RNA抽提试剂盒提取各组干预24 h后的细胞总RNA,测定其浓度阿纯度后进行反转录。PCR检测(上样量=2 μL)程序为:预变性(95 ℃)10 min,变性(95 ℃)10 s,退火(60 ℃)20 s,延伸(72 ℃)34 s。40个循环(复孔=5个)。内参基因为GAPDH,以2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 Cyclin D1和Caspase-3引物序列

1.2.8 蛋白免疫印迹(WB)法检测H9C2细胞中增殖、凋亡与JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达水平 细胞分组同1.2.2,干预24 h时,收集各组细胞,提取蛋白并进行定量后上样,凝胶电泳,转膜,封闭2 h后参照抗体说明书加入一定稀释比例的一抗(JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Cyclin D1及β-actin),孵育过夜(4 ℃),第二天TBST洗涤,加二抗(山羊抗鼠IgG),孵育2 h后进行洗涤(3次),显影液显色后拍照。G代表蛋白灰度值,蛋白相对表达量=(G目的蛋白/G内参蛋白β-actin)。

2 结果

2.1 黄芩苷抑制LPS诱导的H9C2细胞的炎症 ELISA结果显示,与对照组相比,LPS组和LPS+5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组细胞炎症因子TNF-α表达水平显著升高(P<0.05),LPS组和LPS+5、10、20 μmol/L黄芩苷组细胞炎症因子IL-6表达水平显著升高(P<0.05),LPS组和LPS+5、10 μmol/L黄芩苷组细胞炎症因子IL-1β表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平降低,其中LPS+5 μmol/L黄芩苷组的IL-6和IL-1β无显著差异(P>0.05),LPS+10、20和40 μmol/L黄芩苷组均有显著性差异(P<0.05)。见图1。

图1 ELISA法测定黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞炎症因子的影响

2.2 黄芩苷促进LPS诱导H9C2细胞的活力 使用CCK-8法检测黄芩苷对H9C2细胞活力的影响,实验结果显示,干预24 h时,与对照组比较,LPS组和LPS+5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组细胞活力显著降低,除LPS+10 μmol/L黄芩苷组外其余组差异均有显著性(P<0.05);与LPS组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷组细胞活力显著升高(P<0.05),其余组无显著性差异(P>0.05)。干预48 h时,与对照组比较,LPS组和5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组细胞活力均显著降低(P<0.05);与LPS组相比,5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组细胞活力无显著性差异(P>0.05);与24 h相比,48 h LPS组和5、10、20、40 μmol/L黄芩苷组均显著降低(P<0.05)(图2)。为排除细胞活力对后续实验的影响,选择干预24 h与LPS组有显著差异且较低浓度的LPS+10 μmol/L黄芩苷组加入JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490和通路激活剂colivelin进行JAK2/STAT3通路验证实验。

图2 CCK-8法测定黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞活力的影响

2.3 黄芩苷抑制JAK2/STAT3通路促进LPS诱导H9C2细胞的增殖 EdU法检测细胞的增殖,干预24 h,LPS组EdU阳性细胞数变少,黄芩苷处理后EdU阳性细胞数变多(图3A),定量后发现(图3B),LPS组细胞增殖率较对照组显著下降(P<0.05);LPS+10 μmol/L黄芩苷组和LPS+AG490组细胞增殖率较LPS组显著上升(P<0.05);LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组细胞增殖率较LPS+10 μmol/L黄芩苷组显著增加(P<0.05),LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组较LPS+10 μmol/L黄芩苷组显著下降(P<0.05)。

图3 EdU法检测黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞增殖率的影响

2.4 黄芩苷抑制JAK2/STAT3通路减轻LPS诱导H9C2细胞的凋亡 干预24 h后,与对照组相比,LPS组细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷组和LPS+AG490组细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与LPS+10 μmol/L黄芩苷组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组细胞凋亡率显著降低(P<0.05),LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图4。

图4 Hoechst检测黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞凋亡的影响

2.5 黄芩苷促进LPS诱导H9C2细胞Cyclin D1蛋白表达并抑制Caspase-3蛋白表达 对增殖凋亡相关Cyclin D1和Caspase-3蛋白表达水平进行检测,结果显示,LPS组Cyclin D1蛋白水平较对照组显著下降,而Caspase-3蛋白水平较对照组显著上升(P<0.05);LPS+10 μmol/L黄芩苷组和LPS+AG490组Cyclin D1蛋白水平较LPS组显著上升,Caspase-3蛋白水平较LPS组显著下降(P<0.05);LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组Cyclin D1蛋白水平较LPS+10 μmol/L黄芩苷组显著上升,Caspase-3蛋白水平较LPS+10 μmol/L黄芩苷组显著下降(P<0.05),LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组Cyclin D1蛋白水平较LPS+10 μmol/L黄芩苷组显著下降,Caspase-3蛋白水平较LPS+10 μmol/L黄芩苷组显著上升(P<0.05)。见图5。

图5 黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞中Cyclin D1和Caspase-3表达水平的影响

2.6 黄芩苷促进LPS诱导H9C2细胞Cyclin D1 mRNA表达并抑制Caspase-3 mRNA表达 对增殖凋亡相关基因Cyclin D1和Caspase-3 mRNA水平检测,结果显示,LPS组Cyclin D1 mRNA表达水平较对照组显著降低,而Caspase-3 mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷组和LPS+AG490组Cyclin D1 mRNA表达水平显著升高,Caspase-3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05);与LPS+10 μmol/L黄芩苷组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组Cyclin D1 mRNA表达水平显著升高,Caspase-3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组Cyclin D1 mRNA表达水平显著降低,Caspase-3 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见图6。

图6 黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞中Cyclin D1和Caspase-3表达的影响

2.7 黄芩苷抑制LPS诱导H9C2细胞JAK2/STAT3通路的活化 为了确定黄芩苷对JAK2/STAT3信号通路活化状态的影响,本研究检测了该通路的关键性蛋白JAK2、STAT3和p-JAK2、p-STAT3的表达水平(图7A),蛋白定量分析结果显示(图7B),各组间JAK2和STAT3蛋白表达水平无显著差异(P>0.05);与对照组相比,LPS组p-JAK2和p-STAT3表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷组和LPS+AG490组p-JAK2和p-STAT3表达水平显著降低(P<0.05);与LPS+10 μmol/L黄芩苷组相比,LPS+10 μmol/L黄芩苷+AG490组p-JAK2和p-STAT3表达水平显著降低(P<0.05),LPS+10 μmol/L黄芩苷+colivelin组p-JAK2和p-STAT3表达水平显著升高(P<0.05)。

图7 WB检测黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

近年来心力衰竭在我国发病率日益增高,已严重威胁人类的生命健康。目前抗心力衰竭的药物很多,但该病仍不能被治愈,患者生活质量和寿命未有显著提升,国家医疗支出不断增加,给患者家庭和社会造成了巨大的负担及经济压力[9]。为此,寻找新的治疗药物尤为重要。在中药辨证论治中,蒋梅先[10]将心力衰竭分期论治,分为两期:慢性稳定期、急性加重期。前者主要是气虚血瘀、气阴亏虚、心肾阳虚,宜益气养阴、益气通络、温补心阳。后者多阳虚水泛、心血瘀滞、痰浊壅肺,宜温阳利水、活血散瘀、化痰降气宣肺;黄芩苷为黄酮类化合物,主要从黄芩苷中提取而来,其在糖尿病、冠心病、高血压以及并发病中应用广泛,且有抗氧化、抗炎症、抑制细胞凋亡的功能,不仅可抑制心梗,还能在缺血再灌注治疗中保护心肌细胞,此外黄芩苷还可以抑制LPS和病毒性心肌炎诱发的心肌细胞凋亡[11]。李萌芳等[12]研究发现,黄芩苷通过调控STIM1-SOCE钙超载减轻LPS引起的心肌细胞凋亡。刘宇等[13]研究发现,黄芩苷可减轻慢性心肌衰竭大鼠心肌损伤,其作用机制可能与上调蛋白激酶B(Akt)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路表达有关。Xue等[14]研究证实,黄芩苷通过芳烃受体抑制炎症并减轻心肌缺血损伤。提示黄芩苷对心肌细胞有广泛的保护作用。本研究发现,LPS诱导后细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平升高,24、48 h细胞活力降低,提示LPS诱导大鼠心肌细胞炎症模型构建成功,且LPS可以降低细胞的活力。与LPS组相比,LPS+10、20和40 μmol/L黄芩苷组IL-6、IL-1β与TNF-α含量降低,24 h LPS+10 μmol/L黄芩苷组细胞活力升高,说明了10 μmol/L黄芩苷可以抑制LPS诱导的H9C2细胞炎症,提高细胞的活力。因此,选择干预24 h的浓度较低的10 μmol/L黄芩苷进行后续的实验,结果表明,LPS诱导后细胞增殖受到抑制,细胞凋亡被诱导增加,加入10 μmol/L黄芩苷处理后,显著逆转了这些指标的变化,证明了黄芩苷可以促进LPS诱导的H9C2细胞的增殖,抑制其凋亡,有良好的医学应用前景。Cyclin D1是细胞增殖过程中标志蛋白,作为细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK)和CDK6的变构调节剂的作用来调节从G1期到S期的转变,Cyclin D1的高表达可促进细胞增殖[15]。细胞凋亡是一种多种因素诱导程序性细胞死亡的生物学过程,Caspase-3是执行细胞凋亡的关键因子,活化后切割多种底物,调节有丝分裂后神经元(PMN)和神经前体细胞(NPC)中的程序性细胞死亡(PCD),在细胞凋亡中起重要作用[16]。本研究发现,LPS诱导后细胞Cyclin D1 mRNA及蛋白表达水平降低,Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高,加入10 μmol/L黄芩苷处理后,显著逆转了Cyclin D1和Caspase-3的表达,提示黄芩苷可能是通过上调Cyclin D1表达和下调Caspase-3表达来促进LPS诱导的H9C2细胞的增殖,抑制其凋亡,研究结果与Xue等[14]研究相一致。

JAK2/STAT3信号通路是广泛参与细胞分化、炎性反应调节的重要通路。研究证实,JAK2/STAT3信号通路在心肌细胞的多种损伤中起关键作用,抑制该通路能明显降低脂质化过氧化产物的生成,进而降低细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤[17]。Das等[18]研究发现,雷帕毒素可通过调控JAK2/STAT3信号通路保护心肌缺血再灌注损伤。Hattori等[19]发现缺血处理可激活JAK2/STAT3信号通路,明显增加p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2表达,减少Bax和Caspase-3表达,从而减少心肌细胞凋亡,改善心脏缺血后收缩功能。另有研究发现,感染性休克时会释放促炎细胞因子,并通过JAK/STAT3通路损害心脏功能,环磷酸腺苷交换蛋白1(Epac1)过表达可抑制JAK/STAT3通路,减轻心肌细胞损伤[20]。以上研究证明了JAK2/STAT3信号通路与心肌细胞的损伤密切相关。此外,有研究表明,黄芩苷可通过抑制JAK2/STAT3信号传导,减少炎症因子的释放,减轻胶原诱导的关节炎[21]。但目前黄芩苷通过JAK2/STAT3信号通路对心肌损伤的影响鲜有报道。因此,本研究分析了黄芩苷对JAK2/STAT3通路的影响,发现LPS诱导后细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白表达升高,加入10 μmol/L黄芩苷处理后,p-JAK2和p-STAT3蛋白表达降低,提示了黄芩苷可能抑制了JAK2/STAT3通路活化状态。所以在LPS+10 μmol/L黄芩苷组中加入JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490和激活剂colivelin进行JAK2/STAT3通路验证实验,发现与LPS+10 μmol/L黄芩苷组相比,AG490增强了黄芩苷对细胞增殖、Cyclin D1表达水平的升高,细胞凋亡及Caspase-3表达、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达的降低,colivelin则削弱了这些变化,以上结果均说明黄芩苷可能通过下调p-JAK2、p-STAT3、Caspase-3蛋白表达水平,上调Cyclin D1蛋白表达水平,促进细胞增殖,并诱导细胞凋亡,这些研究结果与Jin等[20]和Sun等[21]结果相符。

4 结论

黄芩苷可抑制JAK2/STAT3信号通路的活化并上调Cyclin D1和下调Caspase-3表达促进LPS诱导的大鼠心肌H9C2细胞增殖,抑制其凋亡,并缓解其炎症。本研究从细胞功能方面揭示了黄芩苷对LPS诱导的H9C2细胞中的作用,表明了黄芩苷对LPS诱导的心肌损伤的治疗有一定积极效果,并且补充了黄芩苷作用LPS诱导大鼠心肌细胞的一个新的作用机制,但是否存在其他机制参与心肌细胞的生物学行为有待进一步研究。