SOCS3调控JAK/STAT3通路对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠心脏毒性的影响*

符基定 曾丽斯 林颉 韦伊尔 徐维 徐睿 冼乐武

(广州医科大学附属肿瘤医院1.重症医学科;2.肿瘤研究所;3.放疗科;4.胸外科;5.肿瘤内科,广东 广州 510095)

程序性死亡受体1/程序性死亡配体1(Programmed cell death 1/Programmed cell death-ligand 1,PD-1/PD-L1)免疫检查点抑制剂通过阻断PD-1/PD-L1靶向免疫细胞通路,从而抑制肿瘤细胞免疫逃逸,其已被应用于各种类型的癌症治疗[1-2]。但PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂对心血管系统有着明显影响,可产生心脏骤停、心源性休克和完全性房室传导阻滞等严重后果,且炎性反应介导的心脏毒性可涉及心脏的任何部分[3]。已有研究发现PD-1/PD-L1抑制剂可将心脏巨噬细胞极化为M1样表型而诱导心脏损伤[4]。细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)是细胞因子信号转导负调控因子,其在巨噬细胞极化中发挥的重要作用,已有研究发现脂多糖(Lipolyaccharide, LPS)促进大鼠巨噬细胞M1型极化,并显著升高SOCS3的表达进而促进巨噬细胞炎症反应[5-6]。另外,研究发现SOCS3是蛋白酪氨酸激酶/信号转导子与转录激活子3(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3,JAK/STAT3)通路的负调控因子,其直接抑制JAK激酶的活性,进而抑制STAT3的激活,这一现象对克服过度的组织炎症和防止炎症免疫反应期间的组织损伤有重要意义[7-8]。因此,本研究旨在探讨SOCS3调控JAK/STAT3信号通路对巨噬细胞极化的作用机制,以及其在PD-1/PD-L1抑制剂诱导的小鼠心脏毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只SPF级6周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号:SCXK(X)2016-0011],体重(21.0±4.5)g。所有小鼠适应性喂养一周,喂养在18～22 ℃,12 h/12 h明暗交替动物房中,自由饮水喂食。本研究已获得本院实验动物伦理委员会批准(批准号:WDKQSPF/SQ-03)。

1.2 主要实验材料与试剂 小鼠巨噬细胞RAW 264.7购自中国科学院上海细胞库。BMS-1(PD-1/PD-L1 抑制剂,纯度99.56%,HY-19991)、AG490(JAK/STAT3通路抑制剂,纯度99.97%,HY-12000)、LPS(HY-D1056)购自美国(MedChemExpress)MCE公司;pc-SOCS3和对照物、si- SOCS3和对照物购自广州锐博生物科技有限公司;Lipofectamine®3000 Transfection Reagentt转染试剂(L3000-015)购自美国Invitrogen公司;流式细胞术抗体CD86(70-AM08605-50)、CD80(70-AM08005-50)购自杭州联科生物技术股份有限公司;小鼠IL-10(E-EL-M0046c)、TNF-α(E-EL-M3063)和IL-1β(E-EL-M0037c)购自武汉伊莱瑞特公司;抗体SOCS3(ab16030)、CD86(ab220188)、CD80(ab238481)、p-JAK1(ab138005)、JAK1(ab133666)、p-JAK2(ab32101)、JAK2(ab108596)、p-STAT3(ab76315)、STAT3(ab68153)、GAPDH(ab8245)、辣根过氧化物酶标记的二抗(ab288151)购自英国abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染和分组 RAW 264.7细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37 ℃含5% CO2培养箱中培养。细胞传3代后,将所有细胞分为对照组(正常培养)、LPS组[9](LPS 100 ng/mL)、pc-NC组[转染pc-NC(pc-SOCS3对照物)+LPS 100 ng/mL]、pc-SOCS3组(转染pc-SOCS3+LPS 100 ng/mL,使细胞过表达SOCS3)、si-NC组[转染si-NC(si-SOCS3对照物)+LPS 100 ng/mL]、si-SOCS3组(转染si-SOCS3+LPS 100 ng/mL,使细胞低表达SOCS3)、抑制剂组[10](转染si-SOCS3+LPS 100 ng/mL+ JAK/STAT3通路抑制剂AG490 10 μmol/L)。LPS组使用100 ng/mL LPS直接处理细胞24 h,除对照组和LPS组外,各转染组通过Lipofectamine3000试剂分别转染pc-SOCS3和对照物、si-SOCS3和对照物至RAW264.7细胞中,然后使用100 ng/mL LPS处理24 h,抑制剂组细胞转染si-SOCS3后,100 ng/mL LPS和10 μmol/L JAK/STAT3通路抑制剂AG490共处理24 h。

1.3.2 动物造模与分组 所有BALB/c小鼠分为正常组、模型组[6](PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1 10 mg/kg)、si-NC组(10 mg/kg BMS-1+si-NC)、si-SOCS3组(10 mg/kg BMS-1+ si-SOCS3)、抑制剂组[11](10 mg/kg BMS-1+ si-SOCS3+5mg/kg AG490),每组10只。除正常组外,其余各组小鼠每2天腹腔注射10 mg/kg BMS-1,共注射6次,建立PD-1/PD-L1抑制剂诱导的小鼠心脏毒性模型,40只小鼠均造模成功。造模结束后,si-NC组尾静脉注射200 μL si-NC,SOCS3组和抑制剂组尾静脉注射200 μL si-NC和si-SOCS3,浓度均为50 μmol/L,每只小鼠每次注射剂量均为10 nmol,其余小鼠尾静脉注射等量生理盐水。另外,抑制剂组在尾静脉注射si-SOCS3的同时腹腔注射5 mg/kg AG490,其余各组腹腔注射相应剂量生理盐水,所有小鼠连续干预2周,每周3次。最后一次治疗结束24 h后,小鼠称重后麻醉,1 mL一次性无菌注射器自心尖处取血,离心后将血清冻存在-80 ℃备用,然后取出小鼠心脏组织,准确称重后计算心脏指数,各组随机取5只小鼠心脏组织固定在4%多聚甲醛中,另5只冻存在-80 ℃冰箱中。

1.3.3 HE染色观察小鼠心脏组织病理 取出固定在多聚甲醛中的各组小鼠心脏组织,经乙醇脱水后使用石蜡包埋并切成5 μm切片,经脱蜡脱水后使用HE染色。光学显微镜评估心脏组织病理。

1.3.4 ELISA法检测细胞上清和小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β水平 各组细胞上清和小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β水平通过ELISA试剂盒检测,具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 Western blot检测细胞和小鼠心脏组织SOCS3、CD86、CD80、JAK/STAT3通路相关蛋白 提取各组细胞和冻存的小鼠心脏组织总蛋白,BCA法检测蛋白浓度。使用SDS-PAGE分离蛋白质样品,然后转移到PVDF膜上,将其与一抗SOCS3、CD86、CD80、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH在4 ℃下孵育过夜,然后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h,使用ECL试剂显影,Image J软件对蛋白条带灰度值进行量化。

2 结果

2.1 SOCS3对RAW264.7细胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表达 与对照组相比,LPS组细胞SOCS3、CD86、CD80 蛋白表达明显升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显降低(P<0.05);与LPS组和pc-NC组相比,pc-SOCS3组细胞SOCS3、CD86、CD80蛋白表达明显升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达明显降低(P<0.05);与LPS组和si-NC组相比,si-SOCS3组细胞SOCS3、CD86、CD80蛋白表达明显降低,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达明显升高(P<0.05);与si-SOCS3组相比,抑制剂组细胞CD86、CD80蛋白表达明显升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达明显降低(P<0.05),见图1、表1。

表1 SOCS3对RAW264.7细胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表达

图1 SOCS3对RAW264.7细胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表达

2.2 SOCS3对RAW264.7细胞上清TNF-α、IL-1β、IL-10的影响 与对照组相比,LPS组细胞上清TNF-α、IL-1β水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.05);与LPS组和pc-NC组相比,pc-SOCS3组细胞上清TNF-α、IL-1β水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.05);与LPS组和si-NC组相比,si-SOCS3组细胞上清TNF-α、IL-1β水平明显降低,IL-10水平明显升高(P<0.05);与si-SOCS3组相比,抑制剂组细胞上清TNF-α、IL-1β水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.05),见表2。

表2 SOCS3对RAW264.7细胞上清TNF-α、IL-1β、IL-10的影响

2.3 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠心脏指数和病理的影响 与正常组相比,模型组小鼠心脏指数明显升高(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-SOCS3组小鼠心脏指数明显降低(P<0.05);与si-SOCS3组相比,抑制剂组小鼠心脏指数明显升高(P<0.05)(表3)。HE染色结果显示,正常组小鼠心脏组织结构正常,心肌细胞排列整齐;模型组和si-NC组小鼠心脏组织纹理不清晰,结构紊乱,伴有炎性浸润;si-SOCS3组小鼠心脏组织损伤较模型组和si-NC组有所减轻,抑制剂组加重了小鼠心脏损伤,见图2。

表3 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠心脏指数的影响

图2 小鼠心脏HE染色(200×)

2.4 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β的影响 与正常组相比,模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-SOCS3组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显降低,IL-10水平明显升高(P<0.05);与si-SOCS3组相比,抑制剂组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显升高,IL-10水平明显降低(P<0.05),见表4。

表4 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β的影响

2.5 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠心脏组织SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表达 与正常组相比,模型组小鼠心脏组织SOCS3、CD86、CD80蛋白表达明显升高,p-JAK1、p-JAK2、p-

STAT3蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-SOCS3组小鼠心脏组织SOCS3、CD86、CD80蛋白表达明显降低,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显升高(P<0.05);与si-SOCS3组相比,抑制剂组小鼠心脏组织CD86、CD80表达明显升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显降低(P<0.05),见图3、表5。

表5 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠心脏组织SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表达

图3 SOCS3对PD-1/PD-L1抑制剂所致小鼠心脏组织SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表达

3 讨论

巨噬细胞参与了自身免疫和炎症性疾病,在宿主防御和维持内部环境稳定方面发挥极其重要的作用[12]。一般认为LPS会诱导巨噬细胞M1型极化,M1型巨噬细胞通过分泌大量的炎症因子,如IL-1β、TNF-α参与身体的炎症反应[13]。作为SOCS家族的重要分子,大量研究表明SOCS3可被多种炎症因子和抗炎因子诱导表达,并抑制多种免疫分子的信号传导,其也是巨噬细胞功能的重要调节因子[14]。已有研究发现SOCS3可促进巨噬细胞极化为M1型[15]。本研究结果发现LPS诱导巨噬细胞后,SOCS3表达明显升高,并且刺激细胞分泌IL-1β、TNF-α促炎因子,抗炎因子IL-10分泌减少,M1型巨噬细胞标志物CD86和CD80表达明显升高,过表达SOCS3后,巨噬细胞M1型极化和炎症反应进一步增加,低表达SOCS3抑制了巨噬细胞M1型极化和炎症反应,表明LPS成功诱导了巨噬细胞M1型极化,SOCS3参与巨噬细胞M1型极化。

SOCS3通过抑制STAT3的磷酸化及其二聚体的形成或者直接抑制JAK的磷酸化负向调节JAK-STAT3 信号通路,在免疫炎症反应中起关键作用[5]。Chi等[16]研究发现敲低SOCS3的表达,明显激活JAK2/STAT3信号通路并抑制巨噬细胞M1极化。另外,Geng等[17]研究发现,LPS刺激后,SOCS3需达到一定水平后,才可抑制JAK/STAT信号通路。本研究结果显示,LPS明显促进SOCS3的表达,而抑制JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表达,低表达SOCS3后,JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表达明显升高,并明显抑制巨噬细胞M1型极化,使用JAK/STAT3通路抑制剂后,逆转了SOCS3低表达对巨噬细胞M1型极化和炎症反应的的抑制作用,与Chi等[16]结果基本一致,表明低表达SOCS3可通过激活JAK/STAT3通路抑制巨噬细胞M1型极化。

PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已在抗肿瘤治疗中取得了巨大的成功,但其会诱发广泛的免疫相关不良事件,其中心脏毒性是最致命的不良反应[18-19]。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂诱发的心脏毒性中炎症因子风暴会引发强自由基反应,进而破坏心脏屏障,加重心脏损伤[20-21]。已有研究发现PD-1/PD-L1治疗后引起的炎症因子风暴会使巨噬细胞向M1型极化进而分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子促进炎症反应[22]。Chen等[23]研究发现PD-1/PD-L1抑制剂可促进巨噬细胞M1型极化,并通过增加小鼠炎症反应诱导黑色素瘤小鼠心肌细胞凋亡和心脏毒性。本研究结果显示,PD-1/PD-L1抑制剂明显诱导小鼠心脏毒性,小鼠血清TNF-α、IL-1β水平、心脏组织SOCS3、CD86、CD80蛋白表达明显升高,小鼠血清IL-10水平显著降低;抑制SOCS3表达后,明显减轻小鼠心脏毒性,小鼠血清TNF-α、IL-1β水平、心脏组织SOCS3、CD86、CD80蛋白表达明显降低,小鼠血清IL-10水平明显升高,表明SOCS3参与调控PD-1/PD-L1抑制剂诱导的小鼠心脏毒性,低表达SOCS3可抑制小鼠巨噬细胞M1型极化并抑制小鼠炎症反应。另外,经PD-1/PD-L1抑制剂诱导后,小鼠心脏组织JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表达明显降低,低表达SOCS3小鼠心脏组织JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表达明显升高,JAK/STAT3抑制剂逆转了低表达SOCS3对小鼠心脏组织毒性的减轻作用以及炎症抑制作用,表明抑制SOCS3表达可通过激活JAK/STAT3信号通路减轻PD-1/PD-L1抑制剂对小鼠的心脏毒性,为临床PD-1/PD-L1抑制剂诱导的心脏毒性损伤修复提供新的治疗靶点。

4 结论

在PD-1/PD-L1抑制剂诱导小鼠心脏毒性和巨噬细胞M1型极化中,SOCS3的表达明显升高,抑制SOCS3的表达可通过激活JAK/STAT3信号通路,减轻PD-1/PD-L1抑制剂诱导小鼠心脏毒性,并抑制巨噬细胞M1性极化,表明SOCS3可作为PD-1/PD-L1抑制剂诱导的心脏毒性损伤的新的治疗靶点,为临床治疗PD-1/PD-L1抑制剂诱导的心脏损伤提供理论依据。