携带不同耐药基因对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌适应性及毒力的影响*

2024-03-21瞿巧莉李霄王鹏飞胡莹单斌毛俊陈如才

西部医学 2024年3期

瞿巧莉李霄王鹏飞胡莹单斌毛俊陈如才

(1.昆明医科大学第二附属医院检验科,云南昆明 650101;2.云南大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室,云南昆明 650032;3.昆明医科大学第二附属医院中心实验室,云南昆明 650101;4.昆明医科大学第一附属医院检验科,云南昆明 650001)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是自然界中常见的革兰氏阴性肠杆菌,主要分布于人体内胃肠道和鼻咽部的正常寄居菌群[1]。当其生态位发生改变或者人体免疫力降低时,可引起肺炎、下尿路感染、菌血症等严重的感染性疾病,是社区和院内感染最常见的机会致病菌之一[2];尤其对于ICU患者、有手术治疗史及接受气管插管等创伤性操作史的患者,肺炎克雷伯菌感染将带来致命性的后果[3]。然而,随着抗生素的不合理使用,肺炎克雷伯菌对多种抗生素的耐药性正逐年增加,2017年曾倩倩等[4]的回顾性调查发现,肺炎克雷伯菌对头孢吡肟、阿米卡星、头霉素等各类常用抗生素的耐药率也呈不同程度上升,使得碳青霉烯类抗生素成为了对抗肺炎克雷伯菌的最后一道防线[5]。然而,近十年来耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的检出率呈逐年上升趋势[6]。这将给临床感染的治疗及控制带来巨大的挑战。有研究报导,我国目前流行的CRKP主要为CG258(Clonal group)克隆的ST11型菌株,占我国CRKP的60%[7]。CRKP的耐药性主要通过菌体产生碳青霉烯酶水解抗生素所赋予,碳青霉烯酶基因通常由CRKP的大型耐药质粒携带,常见的类型包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM及blaIMP等[8-9]。Bedhomme等[10]研究表明大型耐药质粒的携带会带来差异适应性。由于质粒的运输成本,所以会造成宿主菌适应性的降低,除此之外适应性还与携带耐药基因的质粒拷贝数相关。Newbury等[11]研究也证实了细菌长期暴露于抗生素环境中可能会增加质粒-宿主之间的连接性,其所携带的多个质粒之间会存在互利或拮抗的相互作用。虽然携带耐药基因的大型质粒能为宿主菌带来抗生素耐药性,但如此大型的质粒对宿主菌更广泛的适应性效应及毒力影响尚不明确[12]。本研究主要通过探究携带不同耐药基因的质粒以及携带单个或多个耐药基因的质粒对CRKP环境适应性及毒力作用的影响,以期对临床CRKP的感染控制与治疗提供重要的理论依据和用药指导。

1 材料与方法

1.1 材料 ①细菌及线虫:收集2011年～2015年昆明医科大学第二附属医院CRKP临床分离株共10株。N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C. elegans)、大肠杆菌E.coli OP50、肺炎克雷伯菌质控菌株ATCC10031、肺炎克雷伯菌ATCC700603均购自American Type Culture Collection,ATCC(https://www.atcc.org/)。②培养基:NGM线虫培养基配方(1L): NaCl 3 g,蛋白胨2.5 g,琼脂17 g,胆固醇(5 mg/mL,无水乙醇配置,过滤除菌)1 mL,高压灭菌后加入过滤除菌的1 M CaCl21 mL,1 M MgSO41 mL,1 M磷酸盐缓冲液(pH=6.0)10 mL倒入平板,过夜晾干后加适量E.coli OP50单克隆菌液制成NGM发育板上,加适量CRKP分离株的单克隆菌液制成NGM检测板备用;LB液体及固体培养基按常规方法配置[13-14]。③主要试剂及缓冲液:M9缓冲液(1 L):七水磷酸氢二钠5.8 g,磷酸二氢钠3.0 g,氯化钠5.0 g,七水硫酸镁0.25 g,添加ddH2O至1 L,高压蒸汽灭菌备用;线虫 Bleach裂解液(100 mL体系):5 M NaOH 10 mL,次氯酸钠20 mL(5%有效氯含量),ddH2O 70 mL,4 ℃避光储存备用;1 M磷酸盐缓冲液(pH=6.0):KH2PO4117.3 g,K2HPO424.0 g,添加ddH2O 至1 L,高压灭菌备用;线虫冻存液 (1 L):NaCl 5.85 g,KH2PO46.80 g,甘油300 mL,1 M NaOH 5.60 mL,灭菌后加入0.3 mL无菌1M MgSO4备用。

1.2 细菌耐药基因型鉴定根据检验科VITEK平台的药敏及菌种鉴定结果,收集昆明医科大学第二附属医院CRKP临床分离株10株,根据《全国临床检验规程》对菌株进行分离、纯化、保菌备用。采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA,利用PCR技术对碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP,β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、blaLAP进行扩增,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,随后对阳性条带进行测序、Blastn比对分析。肺炎克雷伯菌ATCC10031、ATCC700603作为对照菌株。见表1。

表1 各耐药基因PCR引物

1.3 菌种鉴定及MLST分型扩增16S rRNA基因,sanger双向测序后进行Blastn比对分析,鉴定菌种;PCR扩增七个管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB),sanger双向测序后通过等位基因数据库比对鉴定其ST类型(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)。

1.4 细菌生长曲线测定分离纯化后的菌株从-80 ℃取出,接种于5 mL未添加亚胺培南抗生素的LB液体培养基中,200 rpm,37 ℃摇菌复苏培养4 h。将复苏后的细菌在无抗性LB平板上划线过夜培养,挑取单克隆菌落在5 mL无抗LB液体培养基中增殖培养8～12 h,待细菌进入指数生长期后,用无菌PBS稀释菌液至OD600=0.1(MCF=0.13～0.14),取稀释后的菌液50 μL接种至加有5 mL LB液体培养基的浊度瓶中,加入亚胺培南抗生素,浓度分别为:0、2和8 mg/mL,200 rpm,37 ℃摇菌培养。测定浊度瓶初始MCF值,之后每隔30 min测定一次MCF值,连续测定24 h。每个分离株的各抗生素浓度组平行培养2瓶,整体实验重复两次。利用GraphPad Prism 6.0软件绘制生长曲线,采用Kruskal-Wallis检验法对组间数据进行差异显著性分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

1.5 线虫侵染实验

1.5.1 线虫复苏及同步化取冻存的线虫室温融化,用10 mL M9缓冲液洗涤,静置后弃上清液。将线虫沉淀加入到含有E.coli OP50的NGM发育板上,20 ℃培养2～3 d,期间显微镜下观察线虫发育情况、密度及产卵情况,直到平板上有大量虫卵或者线虫体内有大量虫卵。用3 mL M9缓冲液将线虫及虫卵从平板上冲洗下来,得到的混悬液装到15 mL离心管,离心弃上清。用5 mL M9缓冲液洗涤、离心、弃上清,尽量将细菌洗净,剩余沉淀即为线虫和虫卵。加入2倍体积的线虫裂解液,剧烈漩涡震荡5 min直至液体变得清亮,离心弃上清。此时剩下的沉淀为虫卵,加入10 mL M9缓冲液重悬虫卵,离心弃上清,重复两次,以去除残余的线虫裂解液。再加入1 mL M9缓冲液重悬虫卵,吸取1～2 μL虫卵液至载玻片上推开,在显微镜下观察虫卵数量及裂解效果,将重悬后的虫卵倾斜放置于20 ℃培养箱孵化,16 h后得到同步化的线虫幼虫。将线虫幼虫加入NGM发育板中,20 ℃培养45～54 h得到同步化的线虫成虫。

1.5.2 线虫侵染在NGM培养基中加入0.2 mmol/L的氟尿苷(Floxuridine,FUDR)以抑制线虫繁殖,倒板,取过夜培养的单克隆菌液用M9缓冲液稀释25倍后铺至无抗生素的NGM平板,配置成NGM检测板,对照组采用肺炎克雷伯菌ATCC10031和ATCC700603菌株配置。将同步化的线虫成虫用M9缓冲液从发育板上洗脱下来,离心弃上清,加入适量M9缓冲液重悬,取适量重悬后的线虫加到NGM检测板及NGM对照板上,在体式解剖镜下计数线虫数量,控制每个平板线虫数为(50±5)条,每个分离株做两个平行检测板,整体实验重复两次。

1.5.3 绘制线虫生存曲线每天同一时间段在显微镜下观察线虫的存活情况,记录每日死亡数量,线虫死亡的判定标准:虫体僵直,肿胀破裂,轻轻敲打平板线虫仍不能运动。利用GraphPad Prism 6.0软件绘制线虫生存曲线,Log-rank检验法对组间数据进行差异显著性分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌耐药基因型鉴定 10个分离株耐药基因鉴定结果见图1、表2。

图1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因型电泳图

表2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因型鉴定及MLST序列分型

2.2 细菌菌种鉴定及ST分型通过对10个分离株进行16S rRNA基因验证,对sanger测序结果进行Blastn比对,确认10个分离株均为肺炎克雷伯菌;对七个管家基因PCR扩增后测序,MLST等位基因比对后,得到5种ST类型,其中ST-11型和ST-290型各三株、ST-395型两株、ST-340型和ST-437型各一株。见表2。

2.3 菌株生长曲线根据碳青霉烯类耐药基因鉴定结果,对分离株进行分组(表3),绘制生长曲线。在没有抗生素压力下,各组菌株生长趋势基本一致,在2～5 h处于指数生长期,细菌生长迅速;第5～24 h生长曲线趋于稳定,处于平台期,体系MCF值趋于稳定,各组生长曲线差异无统计学意义(P>0.05)(图2A)。在2 mg/mL亚胺培南压力下,对照组全程未见生长,所有分离株均在4 h后才开始进入指数生长期,6 h后进入平台期(图2B),携带单个耐药基因组中blaIMP组细菌总量最低,其次为blaKPC组;携带双耐药基因组中blaKPC+blaNDM组、blaIMP+blaOXA组细菌总量最高。采用Kruskal-Wallis检验法对组间数据进行差异显著性分析发现,除blaNDM组、blaOXA组与blaNDM+blaOXA组比较没有差异,携带单个耐药基因与携带双耐药基因对细菌的生长适应性和细菌总量有不同的影响,差异均有统计学意义(P<0.001)(图3)。在8 mg/mL亚胺培南压力下,对照组全程未见生长,其余各组菌株表现出不同程度的适应性差异(图2C)。其中blaKPC组、blaKPC+blaNDM组最快进入指数生长期(4～6 h),其次为blaNDM组,blaOXA组在第14 h才开始生长,15～17 h处于对数期;blaKPC组在从16 h开始曲线出现下降趋势进入衰亡期。细菌总量以blaKPC+blaNDM组最高,blaIMP+blaOXA组最低。采用Kruskal-Wallis检验法对组间数据进行差异显著性分析发现,单耐药基因组中blaNDM组和blaIMP组适应性强于blaOXA组,差异具有统计学意义(P<0.001);双耐药基因组中blaKPC+blaNDM组和blaNDM+blaOXA组分别比单耐药基因组blaKPC和blaOXA生长适应性强,差异具有统计学意义(P<0.001),见图4。

图2 不同抗生素浓度下各菌株的生长曲线

图3 2 mg/mL亚胺培南培养基中各组细菌总量的两两比较

图4 8 mg/mL亚胺培南培养基中各组细菌总量的两两比较

表3 根据菌株携带的碳青霉烯类耐药基因分组

2.4 线虫生存曲线在没有抗生素存在的情况下,用携带不同耐药基因的菌株感染线虫后,绘制线虫的生存曲线(图5),采用Log-rank检验法对组间数据进行差异显著性分析,与对照组(中位生存时间为9 d)相比,blaKPC组、blaKPC+blaNDM组和blaIMP+blaOXA组的生存曲线右移,中位生存时间为10 d,菌株对线虫的毒力作用减弱(P=0.009 2、0.022、0.001 7);blaIMP+blaNDM组生存曲线左移,中位生存时间为8 d,表明菌株对线虫的毒力作用增强,差异具有统计学意义(P=0.0064);其余各组中位生存时间为9 d,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),菌株毒力未表现出增强或减弱。

图5 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对线虫毒力作用比较

3 讨论

CRKP作为目前临床耐碳青霉烯类肠杆菌科(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染的主要病原菌,是临床感染的治疗与控制面临的重大挑战[17]。本研究通过细菌生长曲线及线虫毒力模型,探究携带不同碳青霉烯类耐药基因的CRKP菌株对环境的适应性和对线虫毒力作用的影响,阐述不同碳青霉烯类耐药基因的潜在风险,补充我国CRKP的分子流行特征,为CRKP的爆发流行和感染控制提供理论依据。

本研究通过在不同浓度抗生素压力下测试各菌株的生长曲线来研究耐药基因对CRKP适应性的影响。结果显示,携带有blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株,在没有抗生素的情况下生长速度与其他组没有明显差异;在抗生素存在的情况下,尤其是高浓度抗生素(8 mg/mL)下,生长速度明显高于其他组,说明携带blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株在抗生素环境中适应性更强,这或许是由于其对抗生素的耐受、水解能力增强,将有助于其在抗性环境中增殖与传播。而携带blaOXA的菌株,在高浓度抗生素存在的情况下,生长明显被抑制,这可能是由于其对亚胺培南的水解作用较弱所导致的。所以携带不同的耐药基因会产生不同的适应性效应,在菌株的生长速度和细菌总量上体现出不同的效果。携带blaKPC和blaKPC+blaNDM的菌株在抗生素环境中表现出的较强种群生长增殖能力,使得他们更为广泛传播,而携带其他耐药基因的菌株在高浓度抗生素下生长较弱,所以只是零星爆发。

本研究通过线虫侵染模型探究不同碳青霉烯类耐药基因对菌株毒力的影响。结果显示,在没有抗生素的情况,携带blaKPC、blaKPC+blaNDM和blaIMP+blaOXA耐药基因的菌株感染线虫后,线虫中位生存时间较其他组有所延长,说明对线虫的毒力作用相较于其他菌株更低,而D′Apolito[18]、McLaughlin[19]等的研究结果也表明携带blaKPC会使菌株毒力降低,本文研究结果与其一致。虽然毒力减弱或许更利于临床感染的控制与治疗,但是随着近年来的高毒力耐药株被报道,携带blaKPC的耐药株的毒力作用也在逐渐增强[20],高毒力耐药株的出现也将为临床带来新的挑战。在感染blaNDM+blaIMP菌株后,线虫中位生存时间有所缩短,说明其毒力作用增强了。携带blaNDM、blaIMP、blaOXA、blaNDM+blaOXA与对照组相比差异无统计学意义,说明菌株毒力并没有表现出增强或者减低。Göttig[21]和Liu等[22]研究结果表明携带blaNDM并不会增强菌株的毒力,Jia等[23]的研究结果表明其为低毒力菌株,本研究结果与其一致。而携带blaKPC的菌株毒力强于blaOXA菌株这一点在本研究中并没有得到证实,与Mil-Homens等[24]的研究结果有差异。

碳青霉烯类耐药基因一般位于大型质粒上,由于质粒之间存在相互作用,所以携带单个耐药质粒与携带多个耐药质粒所带来的适应性和毒力作用不同[25]。在细菌生长曲线测试结果可以看出,携带多个耐药质粒最终对细菌适应性的影响似乎有加乘效应。在抗生素存在时,单独携带blaKPC或blaNDM的菌株生长适应性都较强,同时携带blaKPC和blaNDM的菌株表现出了强于单独携带时的适应性。而且在blaIMP和blaOXA组也能观察到相似的效应:同时携带blaIMP和blaOXA的菌株比单独携带blaIMP或blaOXA的菌株表现出了更强的适应性,生长速度和细菌总量明显高于单独携带的菌株。但是在线虫毒力模型中,携带双抗性质粒的菌株,毒力作用的改变并不是两个耐药质粒毒力作用的简单加乘或拮抗效果,由于本研究涉及样本量较小,双耐药质粒对毒力作用的影响规律和作用机制还需要更进一步研究。

值得注意的是,结合耐药基因与ST分型数据,本研究发现在本研究中所有ST11型菌株都恰好携带了blaKPC抗性基因。携带blaKPC基因所带来的低毒力效应及高浓度抗生素压力下的强适应性、强增殖能力,可能正是导致ST11型菌株成为我国CRKP的主要流行克隆株。

适合度代价是指在没有选择压力的情况下,携带耐药质粒的菌株相较于没有该质粒的菌株表现出来的生长缓慢、竞争力减弱和(或)毒力减低等现象[26]。本研究发现无抗生素时,blaKPC组和blaKPC+blaNDM组菌株对线虫的毒力作用有所降低,说明这两组菌株可能存在一定的适合度代价。这可能是由于获得耐药质粒为宿主菌带来了额外的DNA复制负担,从而对细菌细胞的复制速率产生了负面影响[27],生长增殖速度降低;菌株在提高环境适应性的同时,通过降低自身毒力,以减轻宿主菌的代谢负担,利于菌株的增殖与传播。在选择压力存在的条件下,携带有耐药质粒的菌株优势就得以彰显,将会表现出更高的环境适应性和更强的抗生素耐受能力。本研究中这两组菌株在抗生素存在时显示出明显的生长优势,也印证了适应性代价的存在。Li等[28]研究也证实了blaKPC基因的表达会带来适应性代价,对菌株产生负面影响。对于blaKPC+blaNDM双抗性菌株,临床报道并不多,在Gao等[29]研究中,利用大肠杆菌EC600作为受体菌,获得的双抗性转化株并不存在适应性代价,与本研究所采用双抗性原始分离株进行测试的结果不符,这可能是因为耐药质粒存在宿主菌依赖性。Di等[30]研究表明blaKPC在CRKP和在E.Coli中的适应度成本不一样,说明质粒-宿主菌的相互作用是特异性的,不同遗传背景的宿主菌基因表达会影响质粒基因的表达,这或许可以解释为什么本研究中blaKPC+blaNDM双抗性菌株存在适应性代价,而Gao等[29]的研究中却有不一样的结果。