HLA-DRA蛋白在肝细胞癌中的表达及其临床意义

陈琨 杨慧 刘子嘉 张晓林 徐卓一 刘柄 赵玉宝 丁璐 邓阳

作者单位：250000 济南 1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）公共卫生与健康管理学院；2.山东第一医科大学（山东省医学科学院）临床与基础医学院；271000 泰安 3.山东第一医科大学第二附属医院感染性疾病科；250000 济南 4.济南市中心医院公共卫生科

原发性肝癌居最常见恶性肿瘤的第六位和肿瘤死亡原因的第三位［1］。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌病例的80%以上，是其主要的组织学亚型［2］。大多数HCC 患者不具有特异性的临床表现，且病情进展迅速，确诊时往往已进展到中晚期，远期预后差［3］。因此，探寻可用于HCC早期诊疗和预测预后的生物标志物极其重要。

人类白细胞抗原DRA（human leukocyte antigen-DRA，HLA-DRA）属于HLA-Ⅱ类分子α链旁系同源基因，其编码的α 链和HLA-DRB 编码的β 链以非共价键结合组成异二聚体糖蛋白分子，即HLA-Ⅱ类分子［4-5］。HLA-Ⅱ类分子表达于抗原呈递细胞表面，通过向T 细胞呈递外源性抗原肽，在免疫应答和免疫调控中发挥关键作用［6］。在肿瘤中，HLA-DRA呈递肿瘤相关抗原被CD4+T 细胞识别，产生细胞因子如白细胞介素和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ），以抑制肿瘤生长［7］。前期研究发现HLA-DRA 蛋白表达于甲状腺乳头状癌［8］、宫颈癌［9］、膀胱癌［10］、肾透明细胞癌［11］等肿瘤组织，并发挥免疫调控作用。然而，目前HLA-DRA 在HCC 中表达情况及临床意义尚不清楚。因此，本研究通过免疫组织化学法检测HCC 组织和对应癌旁组织中HLA-DRA 蛋白的表达情况，分析HLA-DRA 蛋白表达水平与患者临床病理特征以及术后预后之间的关系，以期为HCC 患者提供新的早期诊断标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016 年7 月至2022 年3 月在山东第一医科大学第二附属医院和济南市中心医院接受肝癌根治性切除术的HCC 患者作为研究对象。纳入标准：⑴手术切除标本经病理组织活检诊断为HCC；⑵术前未接受过手术治疗、放化疗、免疫治疗等。排除标准：⑴同时患有严重影响生存的心脏、肾脏、肺部等疾病或其他类型的恶性肿瘤；⑵临床资料和随访资料不完整。术中同时取得原发灶组织和癌旁组织，其中癌旁组织距离癌灶边缘2 cm 以上并经病理学诊断证实为正常组织。本研究获得山东第一医科大学伦理委员会批准（审批号：伦审20231356号）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测HLA-DRA 蛋白表达水平 将10%福尔马林溶液固定的组织进行石蜡包埋，连续切片（切片厚度为4µm）。采用SP 法对切片进行染色，二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化、3% H2O2溶液处理内源性过氧化物酶、热修复抗原。加入1∶100 稀释的HLA-DRA 一抗（AJ1362a，Abgent 公司），4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗。DAB溶液显色，苏木精复染，二甲苯洗片透明处理，中性树脂封片，在显微镜下观察切片。

1.2.2 结果判定及评分 随机选择5 个高倍镜视野（×400）对每张切片中的阳性细胞进行计数。HLA-DRA蛋白主要表达于细胞膜和（或）细胞质，以细胞膜和（或）细胞质中出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性细胞。计算阳性细胞百分比，该百分比≤5%、6%～25%、26%～50%和＞50%分别计为0、1、2、3分。观察细胞染色情况，根据染色强度计分，其中细胞无染色、浅黄色、棕黄色和棕褐色依次计为0、1、2、3 分。以阳性细胞百分比评分×细胞染色强度得分计为总评分［12］，总评分0 分判定为阴性（-），1～2 分为弱阳性（+），3～4 分为中度阳性（++），6～9分为强阳性（+++），将（-）或（+）判定为低表达，将（++）或（+++）判定为高表达。

1.3 资料收集与随访

通过查阅病历资料，收集患者性别、年龄、HBV感染情况、BCLC 分期、肝硬化、Child-Pugh 分级、肿瘤大小、包膜完整性、微血管侵犯等资料。根据《原发性肝癌诊疗指南（2022 年版）》［13］建议的随访方案，在患者出院后采用门诊复查的方式进行随访，两年内每3 个月随访1次，随后每6个月进行1次，随访截至2023年6月30日。总生存期（overall survival，OS）是指从患者进行手术的当天开始到因任何原因导致死亡的时间，无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）是指从手术当天开始至肿瘤复发或随访截止日期或死亡日期（以先发生者为准）。

1.4 统计学方法

利用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8 软件分析数据以及绘制统计图。以例数（n）表示分类资料，两组分类资料的比较采用χ2检验。利用Kaplan-Meier法描述HLA-DRA 表达水平与HCC 患者术后OS 和RFS 的关系，Log-rank 检验比较不同HLA-DRA 表达水平患者OS 和RFS 的差异。应用单因素和多因素Cox 比例风险回归分析HCC 患者术后OS 和RFS 的影响因素。以双侧P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的临床病理特征

本研究共纳入273例HCC患者，其中男性235 例，女性38例；50岁及以下患者95例，50岁以上患者178例；HBsAg阳性者224例，阴性者49例；HBV DNA≤103IU/mL者144例，＞103IU/mL者129例；ALT≤40 U/L者104 例，＞40 U/L 者169 例；AST≤40 U/L 者96 例，＞40 U/L 者177 例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）≤400µg/L 者79 例，＞400µg/L 者194 例；肿瘤直径≤5 cm 者168 例，＞5 cm 者105 例；161例患者伴有肝硬化，112例患者不伴有肝硬化；Child-Pugh 分级A 级248 例，B 级25 例；BCLC分期0/A期137例，B/C期136例；93例无包膜/包膜不完整，180 例包膜完整；96 例发生微血管侵犯，177例未发生微血管侵犯。

2.2 HLA-DRA 蛋白在HCC 组织和癌旁组织中的表达情况

HLA-DRA 蛋白在HCC 组织中的高表达率为39.19%（ 107/273），低于癌旁组织的72.89%（ 199/273），差异具有统计学意义（χ2=62.927，P＜0.001）。见图1。

图1 HLA-DRA蛋白在HCC组织和癌旁组织中的表达（SP，×400）Fig.1 Expression of HLA-DRA protein in HCC and paracancerous tissues (SP, ×400)

2.3 HLA-DRA 蛋白表达与HCC 患者临床病理特征的关系

HCC组织中HLA-DRA蛋白高表达与AFP＞400µg/L（χ2=8.984，P=0.003）、伴有肝硬化（χ2=6.223，P=0.013）、BCLC B/C 分期（χ2=9.910，P=0.002）、无包膜/包膜不完整（χ2=7.616，P=0.006）以及微血管侵犯（χ2=4.727，P=0.030）有关，但未发现与患者性别、年龄、HBsAg、HBV DNA、ALT、AST、肿瘤大小以及Child-Pugh分级有关（均P＞0.05）。见表1。

表1 HLA-DRA蛋白表达与HCC患者临床病理特征的关系Tab.1 Association between HLA-DRA protein expression and clinicopathological characteristics of patients with HCC

2.4 HLA-DRA蛋白表达与HCC患者预后的关系

截至2023 年6 月30 日，273 例HCC患者的中位OS 为45.07（95%CI：34.01～56.13）个月，1、3 和5年OS率分别为77.4%、55.3%和37.9%。107例HLA-DRA蛋白高表达者中位OS为55.35（95%CI：48.83～61.87）个月，1、3和5年OS率分别为86.6%、65.4%和40.1%，而166例低表达者中位OS为30.58（95%CI：15.45～45.71）个月，1、3 和5 年OS 率分别为70.8%、47.5%和38.6%。Logrank 检验显示，HLA-DRA 高表达者OS 率高于低表达者（χ2=4.336，P=0.037），见图2A。

图2 HLA-DRA蛋白表达与HCC患者预后的关系Fig.2 Association between HLA-DRA protein expression and prognosis of patients with HCC

HCC 患者的中位RFS 为15.60（95%CI：11.27～19.94）个月，1、3和5年RFS率分别为56.4%、31.3%和18.7%。107 例HLA-DRA 蛋白高表达者中位RFS 为33.05（95%CI：24.03～42.07）个月，1、3 和5 年RFS 率分别为70.2%、41.6%和22.0%，而166 例低表达者中位RFS为11.40（95%CI：9.41～13.39）个月，1、3和5年RFS率分别为46.1%、22.9%和17.5%。Log-rank检验显示，HLA-DRA 高表达者RFS率高于低表达者（χ2=13.396，P＜0.001），见图2B。

2.5 影响HCC 患者预后的单因素和多因素Cox 比例风险回归分析

单因素分析发现AFP、伴有肝硬化、BCLC 分期、无包膜/包膜不完整、微血管侵犯、HLA-DRA 表达水平与HCC患者OS相关（均P＜0.05）。多因素分析结果显示，AFP＞400µg/L、伴有肝硬化、BCLC B/C 分期、无包膜/包膜不完整、微血管侵犯是HCC 患者术后OS 的独立危险因素（均P＜0.05），而HLA-DRA 蛋白高表达是HCC 患者术后OS 的独立保护因素（HR=0.657，95%CI：0.492～0.898，P=0.021）。见表2。

表2 Cox比例风险回归分析影响HCC患者OS的因素Tab.2 Cox proportional hazards regression analysis of factors affecting OS in patients with HCC

单因素分析显示，AFP、伴有肝硬化、BCLC 分期、无包膜/包膜不完整、微血管侵犯、HLA-DRA表达水平与HCC 患者RFS 相关（均P＜0.05）。多因素分析结果显示，AFP＞400 µg/L、BCLC B/C 分期、无包膜/包膜不完整、微血管侵犯是HCC 患者术后RFS 的独立危险因素（均P＜0.05），HLA-DRA 蛋白高表达是HCC 患者术后RFS 的独立保护因素（HR=0.668，95%CI：0.549～0.857，P=0.008）。见表3。

表3 Cox比例风险回归分析影响HCC患者RFS的因素Tab.3 Cox proportional hazards regression analysis of factors affecting RFS in patients with HCC

3 讨论

正常情况下HLA-DRA 仅表达于几种免疫活性细胞中，但是在病理状态下如病毒感染、自身免疫性疾病和肿瘤发生时，HLA-DRA 蛋白表达增加，主要发挥抗原呈递和T 细胞激活调控，将肿瘤抗原性多肽呈递给CD4+T 细胞，使肿瘤细胞被免疫细胞识别并杀伤，抑制肿瘤发生发展［14-15］。然而，肿瘤组织中HLA-DRA 蛋白表达水平下降，诱导HLA-DRA基因启动子区和/或Ⅱ类反式激活因子的高甲基化或低乙酰化，使Th1 细胞因子如IFN-γ 和TNF-α 分泌减少，进而抑制CD8+T 细胞的激活，最终导致肿瘤免疫监视缺失［7，16］。

由IFN-γ 诱导的HLA-DRA 是CD4+T 细胞识别肿瘤相关抗原所必需的。有研究报道，在癌旁的正常结直肠上皮中HLA-DRA 呈高表达，而结直肠癌组织中HLA-DRA 表达水平较低，且HLA-DRA mRNA 表达与组织中的IFN-γ mRNA 水平相关，IFN-γ 则通过stat1依赖性机制抑制体内c-myc 的表达，这种非免疫机制使患者预后更好［17］。YAN 等［18］对宫颈鳞状细胞癌中的HLA-DRA基因进行GSEA 富集分析，发现其主要富集于免疫或肿瘤相关信号通路，包括PD-1 检查点通路、PD-L1表达、肿瘤T 细胞受体信号通路、Th1/Th2细胞分化途径、NF-κB 信号传导、抗原处理呈递、B 细胞受体信号通路、趋化因子信号通路和Th17 细胞分化等。本研究发现在HCC 组织中HLA-DRA 蛋白高表达率低于癌旁组织，且与多个因素相关，包括AFP＞400µg/L、伴有肝硬化、BCLC B/C 分期、无包膜/包膜不完整以及微血管侵犯等。

HLA-DRA 与多种免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、中性粒细胞和B 细胞的浸润丰度呈正相关，因此检测HLA-DRA 表达的动态变化有助于反映患者的免疫状态，且HLA-DRA 表达降低是T 细胞分化异常的重要原因之一［18］。在肿瘤中，HLA-DRA 高表达常与肿瘤浸润淋巴细胞、瘤周淋巴细胞相关，也与多种肿瘤患者预后良好相关［19］。例如，在结直肠癌组织中HLA-DRA 高表达与患者预后良好相关［17］。安雯等［20］对105 例胃癌组织标本进行免疫组织化学检测发现HLA-DRA 高表达患者相比低表达患者的生存优势更加明显，HLA-DRA 高表达是患者预后的独立保护因素。MATOBA 等［21］发现HCC 组织中HLA-DRA 蛋白低表达与早期肝内复发显著相关，是HCC 早期肝内复发的独立危险因素。还有研究报道，HLA-DRA 在基因和蛋白质水平上的低表达与儿童肾上腺皮质瘤患者OS 降低相关［19］。HLA-DRA 蛋白低表达也可预测骨肉瘤的不良OS 和RFS［22］。HLA-DRA 蛋白高表达的肾透明细胞癌患者OS 较好，且是患者预后的独立保护因素［11］。本研究也发现HLA-DRA 蛋白高表达者1、3 和5 年OS 率和RFS 率均高于低表达者，且HLA-DRA 高表达是患者术后OS 和RFS 的独立保护因素。然而，HLA-DRA 蛋白低表达的非肌肉浸润性膀胱癌患者无进展生存率高于高表达者（P=0.004）［10］。可见，HLA-DRA 表达水平与不同类型的肿瘤患者术后预后的关系存在一定的差异，这可能与HLA-DRA 等免疫相关分子在不同类型肿瘤的免疫应答和进展中发挥促癌或抑癌作用的差异性有关。

本研究也存在以下局限性：⑴未开展功能实验探索HLA-DRA 蛋白在HCC 发生发展中的具体作用机制；⑵本研究属于单中心研究，需要多中心大样本临床研究进行验证。

综上所述，HCC 组织中HLA-DRA 蛋白的高表达率低于癌旁组织，其表达水平与AFP、肝硬化、BCLC分期、无包膜/包膜不完整以及微血管侵犯相关。HLA-DRA 蛋白高表达是HCC 患者预后的独立保护因素。因此，识别HLA-DRA 蛋白的高表达水平可能有助于早期发现HCC病变，从而提供更有效的治疗方案和改善患者预后机会。