丁酸钠通过调节肠道通透性改善酒精性肝病小鼠炎症的机制

田文妍， 张晓旭， 张丽娜， 郭米雪， 刘 健， 李 婷， 杨少奇

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院消化内科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院儿科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004； 4.宁夏医科大学总医院肝胆外科，宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004； 5.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由长期慢性饮酒引起的一系列肝脏疾病的总称[1]。在重度ALD 中，30 d 病死率接近30%。激素及保肝药物是主要的治疗手段，但其生存获益是短暂的。在激素无应答者中，早期肝移植仍然受到很大的限制[2]。因此，寻求安全、高效的方法是治疗ALD 的必然趋势。肠道屏障与其微生物群和肝脏的双向关系是ALD 致病机制中的一个关键环节[3]。当肠道屏障受损时，肠道内微生物群及其产物，如内毒素（endotoxin，LPS）可易位经门静脉入肝并加重炎性反应[4-5]。并且作为肠道来源病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），是机体炎性的重要触发因素。饮酒可导致肠道微生物的组成发生显著变化[6]，增加体循环及外周血的LPS 水平，但其具体机制尚不清楚。丁酸是肠道微生物发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸的一种，已被证实在保护肠道屏障功能、调节免疫应答、改善脂质代谢等方面发挥着重要作用[7-8]。本课题组前期研究[9]表明，给ALD 模型小鼠喂养丁酸钠（sodium butyrate，NaB），能够有效抑制ALD 炎性反应。但是，NaB 如何通过肠—肝轴改善肠道通透性从而使炎性因子水平降低的机制尚不清楚，有待进一步研究。

本研究通过检测肠道绒毛结构的改变、肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 的表达及炎性因子的表达水平，评价NaB 对ALD 小鼠肠道通透性及炎性因子的影响，以期为临床防治ALD 提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雌性8 周龄C57BL/6J 小鼠60 只，体质量为（18±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在宁夏医科大学动物实验中心SPF 级环境下饲养。所有动物实验研究均通过宁夏医科大学伦理委员会伦理审核（No.2020-053）。NaB（纯度为99%）购自美国Sigma 公司；小鼠Lieber-De－Carli 液体饲料及其对照饲料购自南通特洛菲生物科技有限公司；ZO-1（sc-33725）、Occludin（sc-133256）一抗购自美国Santa Cruz 公司，ZO-1 二抗购自美国Abcam 公司（ab6840），Occludin 二抗（BST09K24C01）购自美国Boster 公司，LPS 检测鲎试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司；ELISA 试剂盒购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组 将60 只小鼠适应性喂养1 周后，随机分为阴性对照组、NaB 干预对照组、ALD 模型组、NaB 干预模型组，每组15 只。根据文献[10-11]的方法，对照组给予Lieber-DeCarli 对照液体饮食，模型组给予等热量的Lieber-DeCarli 酒精液体饮食。同时，NaB 干预对照组给予含NaB（0.6 g·kg-1）的液体饮食喂养[12-13]。6 周后，麻醉小鼠，抗凝管收集小鼠外周血、肝脏及肠道组织。

1.2.2 肠道病理学组织的观察 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色检测肠道绒毛结构变化。实验结束后，肠道组织用4%多聚甲醛固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后嵌入石蜡。HE 染色肠道组织切片，在光学显微镜下观察各组小鼠肠道组织形态的变化。

1.2.3 免疫荧光染色检测肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 的表达 收集小鼠肠道组织，用4%多聚甲醛固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后嵌入石蜡进行切片。将切片放入烘箱烤片大约1 h，立即放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及梯度乙醇进行脱蜡，脱蜡后放入PBS 中清洗3 次，每次5 min。然后放入柠檬酸钾修复抗原，加封闭液，37 ℃孵育1 h，孵育完用PBS 清洗3 次，每次5 min。洗后滴加一抗（ZO-1、Occludin）4 ℃孵育过夜。第2 天从冰箱取出复温1 h，回收一抗，PBS 清洗3次，每次5 min。然后滴加荧光二抗，37 ℃避光孵育2 h，甩去二抗，PBS 清洗后加DAPI 封片。

1.2.4 肝脏、肠道及血浆LPS 的测定 按照鲎试剂盒说明书步骤检测肝脏、肠道及血浆中LPS 的表达水平。

1.2.5 肝脏、肠道及血浆炎性因子水平的测定 按照ELISA 试剂盒说明书的操作步骤，检测小鼠组织及外周血的白细胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-17A的表达水平。

1.3 统计学方法

所有数据采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。采用Pearson 相关分析法分析肠道通透性与血浆炎性因子的相关性。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠道病理组织学形态

HE 染色结果显示，与阴性对照组相比，ALD模型组结肠组织可见肠道绒毛结构明显紊乱，固有层可见单个核细胞浸润。与ALD 模型组相比，NaB 干预模型组肠绒毛结构有所改善，见图1。

图1 各组小鼠结肠组织HE 染色结果（HE×40）

2.2 NaB 干预增强ALD 小鼠肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 表达水平

采用免疫荧光染色检测结肠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 的表达水平，结果显示，与阴性对照组相比，ALD 模型组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 的表达降低（P ＜0.05）；与ALD 模型组相比，NaB 干预模型组紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 表达水平升高（P＜0.05）。上述结果表明，NaB 通过增加肠道紧密连接蛋白表达来改善ALD 小鼠肠屏障的完整性，见图2。

图2 NaB 对小鼠结肠紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 表达水平的影响

2.3 NaB 干预减少ALD 小鼠血浆、肝脏及肠道的LPS 水平

与阴性对照组相比，ALD 模型组小鼠血浆、肝脏及肠道LPS 水平均升高（P 均＜0.05）；与ALD 模型组相比，NaB 干预模型组小鼠血浆、肝脏及肠道LPS 水平均降低（P 均＜0.05），见图3。

图3 NaB 干预对ALD 小鼠血浆、肝脏及肠道LPS 表达水平的影响

2.4 NaB 干预抑制ALD 小鼠血浆、肝脏及肠道炎性因子

与阴性对照组相比，ALD 模型组小鼠血浆、肝脏、肠道的IL-6、IL-1β、IL-17A 升高（P 均＜0.05）；与ALD 模型组相比，NaB 干预模型组小鼠血浆、肝脏、肠道的IL-6、IL-1β、IL-17A 均下降（P 均＜0.05），见图4。

图4 NaB 干预对小鼠血浆、肝脏及肠道炎性因子表达水平的影响

2.5 炎性因子水平与肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 的Pearson 相关性分析

相关性分析结果显示，在ALD 模型小鼠中，肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 的降低与肠道炎性因子的水平存在负相关性，随着紧密连接蛋白表达的降低，炎性因子水平升高。NaB 干预模型组小鼠中炎性因子的水平随着肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 表达升高而降低（P 均＜0.05），见图5。

图5 肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1 与肠道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A、LPS 的相关性分析

3 讨论

ALD 是一种代谢性肝病，其病理进展主要由慢性炎症反应驱动，来自肠道微生物群及其产物的病原体相关分子模式LPS 易位到肠系膜淋巴系统和门静脉循环，构成了一种感染的中心机制[14]。肠道微生态失调和肠道屏障完整性的受损是ALD 发病机制的重要因素，肠道通过胆道和门静脉与肝脏连接，PAMPs 可直接通过肠—肝轴进入肝脏，激活促炎信号通路TLR4，导致促炎细胞因子IL-1β、IL-18 等释放，从而加重ALD 小鼠的炎症反应[15-16]。

肠道屏障是机体防止病原微生物及其产物进入体循环的第一道防线，而酗酒可破坏肠屏障完整性[17]。超过一半的酗酒者已被证实有肠道屏障功能障碍和肠道生态失调[18]，从而导致微生物进入体循环，这可能使ALD 小鼠的炎性反应进一步加重。本研究在经典的动物ALD 模型中，采用HE 染色及免疫荧光染色发现小鼠结肠绒毛结构明显紊乱，肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 的表达减少，与上述研究结果一致，表明保持肠道屏障的完整性在预防ALD 中发挥重要作用。并且本实验采用NaB 干预ALD 小鼠模型，发现肠道绒毛结构较ALD 模型组明显改善，肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 的表达也有所升高，表明NaB 具有改善肠道屏障功能的能力，肠源性LPS 易位在乙醇引起的肝脏慢性炎症中起着重要作用。有研究[19]表明，体外浓度在1～10 mmol·L-1的NaB 可改善E12 人结肠细胞功能。本研究发现，NaB 干预能够减少ALD 小鼠肠道、肝脏及血浆中LPS 的含量，提示NaB 通过改善肠道屏障的通透性进而减少肠源性LPS 经过肠—肝轴进入肝脏，从而抑制ALD 小鼠的炎性反应。

在肠道炎性过程中产生的促炎细胞因子，具有重要的肠道紧密连接蛋白的调节作用。有研究[20]表明，IL-1β 诱导肠上皮紧密连接（intestinal epithelial tight junction，IETJ）的通透性增加是肠道炎症的一个重要促进因素。肠道炎症的加重会导致肠道微生物群的改变及肠道细菌的增加，而肠道微生物群的改变及其细菌产物可以激活免疫细胞来调节促炎细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-1β 和IL-6，这些促炎细胞因子反过来作用于紧密连接蛋白，增加屏障通透性[21]。前期研究[9]显示，在ALD 模型组小鼠的血浆及肝脏中，IL-1β 及IL-6 升高，而给予NaB 后炎性因子表达显著下降，改善了ALD 小鼠的炎症反应。也有研究[22]证明干扰素（IFN-γ）、IL-17A在体外可迅速增加血脑屏障和肠上皮屏障的通透性。本研究检测了血浆、肝脏及肠道IL-6、IL-1β、IL-17A，结果表明，ALD 模型组小鼠的肠道、肝脏及血浆IL-6、IL-1β、IL-17A 升高，而NaB干预模型组的IL-6、IL-1β、IL-17A 有所下降，与前期研究[9]结果一致。在此基础上，对各组中的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 的表达水平与肠道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A 的相关性分析发现，紧密连接蛋白的表达水平与肠道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A 的表达呈负相关，表明肠道通透性的增加导致肠道炎性反应加重，进而使肠道内有害物质经过肠—肝轴进入肝脏，导致ALD小鼠炎性反应进一步加重。给予NaB 后，ALD 模型组小鼠紧密连接蛋白表达升高，炎性因子水平表达降低，提示NaB 可通过增加紧密连接蛋白的表达来改善ALD 小鼠的炎症反应[15]。

综上所述，本研究在证实NaB 可改善ALD小鼠肝脏炎症的基础上，进一步探讨其对肠道黏膜通透性的影响。NaB 通过增加肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 的表达来改善肠道通透性，从而减少肠源性LPS 经过肠—肝轴进入肝脏介导的炎性反应，进而发挥负调控作用，抑制ALD 的炎症反应。NaB 作为一种潜在的安全、价格低廉、有效的干预剂，可能为临床ALD 防治提供新的选择。