中性蛋白酶高温酶解条件下猪粪资源化利用中养分的变化规律

戴鹏飞 孙权 解昊郡 王锐 蒋鹏

摘要  以酶工程及酶动力学为技术依托及科学依据，将猪粪加玉米秸秆组合作为底物，添加2%中性蛋白酶，在生化反应釜中80 ℃酶解3 h，底物含水量降低至56.01%，同比下降2.34%；大分子有机质含量降低至63.79%，酶解后，A、B处理的底物有机质含量分别降低了14.19%、15.06%；植物可利用大量元素提高至6.87%，符合NY 525—2012有机肥标准；速效磷、速效钾、全盐、总腐殖酸呈下降趋势；蛔虫卵死亡率达到92%，种子发芽指数达到54%，达到有机肥腐熟标准。

关键词  猪粪；中性蛋白酶；高温酶解；有机肥；养分；变化规律

中图分类号  S141.2  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）04-0051-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.011

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Changes Rule of Nutrients During the Resource Utilization of Pig Manure Under High Temperature Enzymatic Hydrolysis with Neutral Protease

DAI Peng.fei，SUN Quan，XIE Hao.jun et al

（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750021）

Abstract  Based on enzyme engineering and enzyme kinetics as the technical support and scientific basis，the combination of pig manure and corn stover was used as the substrate，2% neutral protease was added，and the water content of the substrate was reduced to 56.01% at 80°C for 3 h in a biochemical reactor，a year.on.year decrease of 2.34%.The content of macromolecular organic matter was reduced to 63.79%，and after enzymatic hydrolysis，the organic content of substrates treated A and B reached 14.19% and 15.06%，respectively.The use of a large number of elements in plants had been increased to 6.87%，which met the NY 525-2012 organic fertilizer standard.Available.available phosphorus，available potassium，total salt and total humic acid showed a downward trend.The mortality rate of roundworm eggs reached 92%，and the seed germination index reached 54%，which reached the standard of organic fertilizer rot.

Key words  Pig manure;Neutral protease;High temperature enzymatic hydrolysis;Organic fertilizer;Nutrient;Change rule

基金项目  宁夏回族自治区重点研发计划项目（2019BCF01001，2022BEG02004）。

作者简介  戴鹏飞 （1998—），男，宁夏固原人，硕士研究生，研究方向：农业资源利用。*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事农业资源和环境教学与科研工作。

收稿日期  2023-03-02

促进畜禽粪污资源化性质开发利用，是实现本地畜禽生产可持续发展的必然選择，是农产品资源环境保护既是农业生产的重要物质基础，也是我国农产品质量安全的根本保证，随着我国人口增加、生活膳食方式的转型以及农村城市化持续推进，我国农产品需求量持续刚性上升，同时民众对自然环境以及农产品安全的需求也日益提高，对维护中国农产品资源环境保护制度提出了更高需求。畜禽饲养产生的粪污中包括了大量的氮、磷物质以及病菌、寄生虫，不仅是农作物面源环境污染的主要污染源，还危害到了养殖户身边的自然环境，甚至危害市民的健康，因此畜禽饲养所产生的粪污已经形成了实现畜禽饲养可持续发展最大的环境障碍［1］。我国作为畜禽养殖大国，庞大的养殖规模下产生的大量养殖粪污是造成农业面源污染的主要来源［2］。未经处理的畜禽粪污在储存过程中还会释放大量有毒气体［3］。同时，畜禽粪便作为一种有机固体废弃物，富含氮、磷、钾和有机物等营养元素，也是农业生产中的重要肥料资源［4］。好氧堆肥是实现畜禽粪便无害化与资源化的生物转化技术［5］，有利于肥料中养分的保持，是我国目前粪便处理的主要方式［6］。堆肥后所得的肥料施于土壤，可以改良土壤，提高土壤肥力，对降低环境压力和实现畜禽养殖业可持续发展具有十分重要的意义［7］。然而，传统的好氧堆肥技术依然存在一些问题，如堆肥时间长、有机物降解不完全、腐殖化程度低、氨气挥发、温室气体释放和重金属活性高等，这些问题不仅会降低堆肥品质，造成二次污染，还会阻碍堆肥产业化的发展［8-9］。

已有部分研究指出，添加不同辅助堆肥材料不仅能够满足微生物发酵所需的水、气、温，还能提高发酵速度，降低臭气及氮素损失等［10-11］。陈云峰等［12］研究表明，添加碳酸盐岩能促进堆肥发酵；吴晓东等［13］研究发现添加柠条生物炭可以缩短堆肥升温期1～2 d，延长堆肥高温期的停留天数2～4 d，提高堆肥质量；徐荣等［14］通过研究筛选出了绿色安全的堆肥添加剂聚天冬氨酸，其对堆肥过程具有氮素固持和重金属钝化的综合作用。而中性蛋白酶在畜禽粪便堆肥中的应用研究较少，因此，探究中性蛋白酶在堆肥中的应用效果能够为畜禽粪污资源化利用提供一定的理论依据。该研究采用全封闭发酵装置，以玉米秸秆为辅料，引进台湾杨秋忠院士发明的粪污酵素发酵技术，以产品理化性状作为评价标准，探究在添加中性蛋白酶高温酶解下猪粪资源化利用中养分的变化规律。

1  材料与方法

1.1  供试原料  供试生猪粪购自养猪场，玉米秸秆购自农户。堆肥添加剂为地天泰农业生技股份有限公司提供的中性蛋白酶ME-101（农业用酵素）。物料理化性质见表1。

1.2  酶解堆肥装置

试验采用地天泰农业生技股份有限公司的全封闭发酵装置进行高温酶解堆肥，利用电热棒加热生物油，生物油供给物料热能量。主体结构装置示意图如图1所示，整个装置为卧式反应罐钢架结构，外壁设有隔热层25 mm，生产罐圆柱体长2.5 m，直径1.1 m，有效容积为85%，罐体由电机旋转，酶解发酵搅拌转速为4.6 r/min，内壁设有螺旋式推进装置。

1.3  酶解方法

试验于2020年5月中旬在宁夏吴忠市红寺堡金宇浩兴养殖基地进行。该试验设置2个处理，处理A

不添加中性蛋白酶为对照，处理B为添加中性蛋白酶。将生猪粪和玉米秸秆按C/N=25∶1混合，再用去离子水调节混合物料含水量至60%，根据物料总量为150 kg，添加3.75 kg中性蛋白酶ME-101（用量为25 kg/t）。各处理不同原料添加量见表2，后开启搅拌旋转控制开关开始升温酶解，总酶解时间为3 h。

1.4  采样和测定指标及方法

采用五点取样法采集酶解样品，采取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h的样品，每份取样500 g装于自封袋，一半于4 ℃条件下保存，另一半自然风干粉碎过筛备用。每隔0.5 h测定肥堆上、中、下3个层次的温度，并记录室温。同时采集铝盒1/3体积的新鲜样品测定含水率。将新鲜堆肥样品与水按1∶10（质量体积比）比例混合振荡2 h，上清液测定pH和电导率。有机质、全氮、全磷、全钾的测定方法参考国标NY 525—2012［15］。 速效氮、速效磷和速效钾的含量分别采用碱解扩散法、碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法、乙酸铵浸提-火焰光度法测定［16］。

种子发芽率的测定参考文献［17］。蛔虫死亡率的测定参考文献［18］。总腐殖酸采用焦磷酸钠浸提-重铬酸钾容量法测定［19］。

1.5  数据统计

试验数据使用Excel 2010整理与作图，SPSS 20.0软件进行显著性检验，显著性水平为P<0.05。测定结果均以平均值±标准误的形式表示。

2  结果与分析

2.1  酶解过程中物料温度的变化

在限定物料温度（80 ℃）和油浴加热温度（120 ℃）下，各处理物料在20 min时均可达到高温发酵温度，油浴30 min后温度均可到达100 ℃以上，高温可以保证供应物料酶解腐熟的热能量。

2.2  酶解前后总腐殖酸含量的变化

腐殖酸含量是影響物料腐熟度及其农用效果的重要参数，如图2所示，A、B处理的总腐殖酸含量均呈先升高后降低的趋势，在1.0 h之前，处理B的总腐殖酸含量高于处理A，处理A在1.5 h时达到最大值（20.61%），处理B在1.0 h时达到最大值（21.29%）。酶解3.0 h时处理A总腐殖酸含量较酶解前（0 h）提高了40.25%，处理B的总腐殖酸含量较酶解前降低了11.57%。腐殖酸中部分易降解物质被微生物分解后，腐殖酸降解量大于其合成量，使得后期腐殖酸含量逐渐下降。

2.3  酶解前后蛔虫卵死亡率的变化

从表3可以看出，酶解后各处理的蛔虫卵死亡率均较酶解前有所提高，其中处理B提高最明显，较酶解前提高了48.39%；处理A酶解后的蛔虫卵死亡率较酶解前提高了23.08%。说明中性蛋白酶能促进物料的腐熟进程。

2.4  酶解前后种子发芽指数（GI）的变化

种子发芽指数（GI）可直接反映酶解物料的腐熟程度。从表4可以看出，高温酶解后不同处理种子发芽指数较酶解前差异明显，各处理酶解后的种子发芽指数均较酶解前的高，处理B提高最明显，提高了1.57倍。而处理A提高并不明显，可能是由于酶解过程中处理A中不断累积的无机盐离子含量过高，从而对种子发芽产生了抑制作用。

2.5  酶解后各处理营养成分比较

从表5可以看出，处理B的有机质相比于处理A提高了54.64%，全氮、全磷和全钾含量均高于处理A，分别提高了21.43%、37.61%、268.70%，总养分含量也达到了6.87%。

2.6  酶解过程中堆体含水量、pH和电导率的变化  在堆肥过程中，物料含水量的变化与微生物活动和温度都密切相关，适当的含水量能提高堆肥的效果，堆肥的最佳初始含水量在55%～65%。如图3a所示，在酶解开始时，A、B处理的初始含水量均较高，分别为56.15%、57.29%，随着酶解的进行，A处理含水率在0～2 h呈现降低趋势，在2～3 h略有上升趋势，在2 h处达到最低点，其值为55.10%。B处理在0～1 h 呈现逐步降低趋势，且在0～1 h下降趋势较大，在1～2 h呈现先上升后下降的趋势，2～3 h也呈现先上升后下降的趋势，在3 h处达到最低点，为56.01%，还没有达到NY 525—2021有机肥标准，后期还需要经过一段时间的晾干。

电导率反映堆肥物料中可溶性盐的含量，是判断堆肥腐熟的必要条件，腐熟后的产品中无机盐离子是植物生长发育所必需物质之一。如图3 b所示，随着酶解的进行，A、B处理的电导率均呈升高趋势。酶解结束后，A、B处理的电导率分别为1.78、4.92 mS/cm，分别较初始时提高了52.14%、35.91%。

如图3c所示，处理A的pH变化不大，趋于稳定，酶解前后的pH分别为8.27和8.33。处理B的pH总体呈下降趋势，酶解前后的pH分别为8.14和7.01。引起pH降低的主要原因可能是物料结构较致密，不能为微生物提供充足的含氮有机物和氧气，造成局部厌氧而导致有机酸积累，并最终导致pH降低。而在1.5～2.0 h，pH出现了小幅度的升高，这是由于酶解中期物料温度较高，微生物代谢蛋白质的活动增强，从而导致氨氮不断产生，最终表现为pH升高。

2.7  酶解过程中物料全量养分含量的变化  物料中的N、P、K的含量决定了物料的利用价值。有机质含量变化反映微生物对纤维素和半纤维素的分解形成腐殖物质的能力。从表6可以看出，A处理的有机质含量在各个时间段低于B处理，说明中性蛋白酶有助于纤维素类物质（玉米秸秆）降解，对于有机质含量具有提升作用，并随着时间段推移，A、B处理的有机质含量均呈逐渐降低，酶解3.0 h时A、B处理的有机质含量分别较酶解前降低了14.19%、15.06%。各处理在酶解3.0 h时有机质含量均达到NY 525-2012有机肥标准。

A、B处理的全氮含量均呈现“升高—降低”的往复循环变化，且升降幅度越来越小，B处理的波动性变化周期更短，B处理的全氮含量大于A处理，酶解3.0 h时A、B处理的全氮含量分别较酶解前降低了16.00%、24.44%；酶解技术发酵氮素损失较低，氮素损失较低的原因可能是封闭装置酶解，接触氧气较少，铵态氮散失能力降低。整个酶解过程都在高温期，随着有机质的腐质化，消耗大量能量，氮素损失能量降低。酶解结束后，不同类肥酶解处理全氮含量损失极低，说明添加中性蛋白酶的处理均能起到保氮效果。

A处理全磷含量在酶解条件下呈现先降低后上升的趋势；B处理的全磷含量呈现先降低后上升的趋势，在2.5 h时达到最大值；B处理各时间段全磷含量均大于A处理，酶解3.0 h时，A处理全磷含量较酶解前升高了15.84%，B处理全磷含量较酶解前降低了10.56%。B处理各时间段

全钾含量均大于A处理，酶解3.0 h时，A处理全钾含量较酶解前升高了64.29%，B处理全钾含量较酶解前降低了36.62%；钾素与磷素性质一致，在酶解发酵过程中，不会因为温度原因和形态转换挥发损失，全钾含量的提升与养分浓缩效益密切相关。

2.8  酶解过程中物料速效养分含量的变化

从图4可以看出，酶解结束后，处理A、Ｂ的速效氮含量低于酶解开始时的含量，A、B处理的速效氮含量分别较初始降低了58.33%、20.35%。

处理A的速效磷含量变化不明显，酶解1.5 h时较酶解前仅提高了5.15%；处理B的速效磷含量变化幅度很大，在0.5 h急剧下降并逐渐趋于平稳，在2.0 h达到最小值（2.08 g/kg），酶解3.0 h时较酶解前降低了35.23%。

相对于处理B，处理A的速效钾含量变化趋势较平稳，酶解3.0 h时较酶解前提高了7.69%；处理B的速效钾含量变化明显，在1.5 h时达到最大值（8.65 g/kg），而后又逐渐降低，酶解结束后速效钾含量为7.58 g/kg，较酶解前降低了8.67%。

3  討论

吴晓东等［13］研究表明在第40天时，添加生物炭可以使鸡粪堆肥产品的水分含量降低至40%左右。该研究结果表明，酶解结束后A、B处理的含水量分别为55.30%、56.01%，这可能是由于物料种类不同造成的，同时这与NY 525—2012标准的含水量（30%）还有较大差距，说明短时间酶解发酵难以降低底物含水量。陈云峰等［12］研究表明，添加碳酸盐岩的猪粪堆肥电导率下降了27.3%，而在该试验结果中，酶解后处理B的电导率较酶解前提高了35.91%，这可能是由于酶解过程中，中性蛋白酶促进了物料有机质的降解，产生了大量有机盐类所引起的。堆体pH的变化主要是由酶解过程中物料发酵所产生的有机酸、氨类成分及其蛋白质所共同引起的。在该研究中处理B的pH明显低于对照，这与徐荣等［14］关于添加聚天冬氨酸会降低堆肥产品pH的研究结果相似。说明在堆肥中添加中性蛋白酶等有机物质有助于降低物料的pH。

经过高温酶解后，A、B处理的有机质含量分别降低至41.25%、63.79%，酶解过程中，各处理有机质含量降低，这可能是由于物料中微生物分解有机物作为其能源并释放CO2所造成的［20-21］。添加中性蛋白酶处理（处理B）的有机质含量明显高于对照（处理A），这与李太魁等［22］关于添加生物炭堆肥能提高堆肥有机质含量的研究结果一致。酶解3.0 h时处理A、B的全氮含量较酶解前均降低，这是由含氮有机物被微生物分解形成氨气挥发导致氮损失所导致的［23］。有研究表明，堆肥会促进无机磷、钾向有机磷、钾的转换［24］，处理B在酶解3.0 h时全磷、全钾含量均有所降低。这可能是由于中性蛋白酶促进了物料中无机磷、钾向有机磷、钾的转化。酶解后添加中性蛋白酶处理的总养分含量显著高于对照，且达到了有机肥标准，这与李太魁等［22］的研究结果一致，说明添加中性蛋白酶也可以有效改善堆肥的质量。在该研究结果中，处理B酶解3.0 h时的速效养分含量较酶解前低，且速效氮、磷、钾的含量分别降低了20.35%、35.23%、8.67%。氮是微生物主要营养来源，氮含量的变化直接反映出微生物的活动状况。添加中性蛋白酶处理的速效氮含量降低，氮素损失明显，这与周文兵等［25］的研究结果一致；速效磷、速效钾含量的降低情况与前人的研究结果［25］相反，其具体机理还有待进一步研究。

有研究表明，随着堆肥发酵的进行，木质纤维素降解形成腐殖酸，大分子腐殖酸被降解和转化为小分子有机物，同时堆肥腐殖酸中含量丰富的氨基酸易被生物降解和利用，其含量随着发酵的进行呈下降趋势［26］，因此在堆肥过程中腐殖酸的含量是逐渐降低的。该研究结果表明，酶解后添加中性蛋白酶处理的总腐殖酸含量明显降低。这也说明中性蛋白酶对腐殖酸的降解有一定的促进作用。试验结果表明，酶解后添加中性蛋白酶处理的蛔虫卵死亡率达92%，显著高于对照，达到了畜禽粪便无害化卫生标准中蛔虫卵死亡率（95%～100%）的要求。种子萌发指数与堆肥产品对植物的毒害性呈负相关，当堆肥产品的种子发芽指数大于70%时则可以达到无害化要求［20］。在该研究中，酶解结束后，添加中性蛋白酶处理的种子发芽指数明显高于对照，但是仅为54%，仍低于标准水平，这与酶解时间过短有关。

4  结论

畜禽粪便中含有非常丰富的氮、磷、钾等营养元素及大量的有机物质，是非常宝贵的肥料资源。该研究通过添加中性蛋白酶在高温酶解下，将粪污资源化利用，旨在减少其污染程度，改变其中的养分含量，为宁夏养殖业的粪污处理提出理论指导，并得出以下结论：

（１）在该研究中，添加中性蛋白酶处理的含水量较高，但未达到 NY 525—2021标准，需进一步优化；pH和电导率的变化都在合理范围内。

（２）有机质含量、全量养分含量达到了有机肥标准，速效养分含量明显高于对照。

（３）高温酶解发酵结束后，添加中性蛋白酶处理的总腐殖酸含量明显降低，蛔虫卵死亡率达到畜禽粪便无害化卫生标准，种子发芽指数表明酶解产品达到对植物无毒害的标准。

（４）各项研究结果表明，研究添加中性蛋白酶可以加快堆肥进程，堆肥后的产品能基本达到腐熟标准。

参考文献

［1］贾丹.浅析提升畜禽粪污资源化利用的重要性［J］.新农业，2022（19）：62-63.

［2］于静，谷洁，王小娟，等.微生物菌剂对鸡粪堆肥过程中氨气排放和微生物群落的影响［J］.西北农业学报，2019，28（11）：1861-1870.

［3］李玥，李成成，李静，等.鸡粪除臭菌的分离筛选及除臭效果分析［J］.农业环境科学学报，2020，39（5）：1103-1110.

［4］AKDENIZ N.A systematic review of biochar use in animal waste composting［J］.Waste management，2019，88：291-300.

［5］杨佳，李国学，马若男，等.腐熟堆肥回流对猪粪堆肥含硫臭气排放的影响［J］.农业环境科学学报，2021，40（11）：2456-2464.

［6］晏琛，曹雷鹏，刘玉环，等.利用新型高温好氧堆肥器提高鸡粪谷壳有机肥肥效［J］.环境工程学报，2021，15（3）：1103-1111.

［7］董红敏，左玲玲，魏莎，等.建立畜禽废弃物养分管理制度  促进种养结合绿色发展［J］.中国科学院院刊，2019，34（2）：180-189.

［8］黄懿梅，曲东，李国学，等.两种外源微生物对鸡粪高温堆肥的影响［J］.农业环境保护，2002，21（3）：208-210.

［9］罗一鸣，李国学，FRANK SCHUCHARDT，等.过磷酸钙添加剂对猪粪堆肥温室气体和氨气减排的作用［J］.农业工程学报，2012，28（22）：235-242.

［10］李国学，李玉春，李彦富.固体废物堆肥化及堆肥添加剂研究进展［J］.农业环境科学学报，2003，22（2）：252-256.

［11］BARTHOD J，RUMPEL C，DIGNAC M F.Composting with additives to improve organic amendments：A review［J］.Agronomy for sustainable development，2018，38（2）：1-23.

［12］陈云峰，丁鲁平，徐金刚，等.添加碳酸盐岩对好氧堆肥发酵过程、养分和腐熟度的影响［J］.中国土壤与肥料，2021（4）：301-307.

［13］吴晓东，邢泽炳，何远灵，等.添加生物炭对鸡粪好氧堆肥过程中养分转化的研究［J］.中国土壤与肥料，2019（5）：141-146.

［14］徐荣，朱凌宇，王守红，等.添加剂对好氧堆肥过程氮素固持和重金属钝化过程的影响［J］.中国土壤与肥料，2021（3）：308-317.

［15］中华人民共和国农业部.有机肥料：NY 525—2012［S］.北京：中国标准出版社，2012.

［16］鲍士旦.土壤农化分析［M］.3版.北京：中国农业出版社，2000.

［17］王馨悦，成艳红，何绍浪，等.基于葛渣肥料化利用的蚯蚓转化技术研究［J］.农业资源与环境学报，2022，39（1）：201-208.

［18］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.肥料中蛔虫卵死亡率的测定：GB/T 19524.2—2004［S］.北京：中国标准出版社，2004.

［19］中华人民共和国农业农村部.畜禽粪便堆肥技术规范：NY/T 3442—2019［S］.北京：中国农业出版社，2019.

［20］AWASTHI M K，WANG Q，REN X N，et al.Role of biochar amendment in mitigation of nitrogen loss and greenhouse gas emission during sewage sludge composting［J］.Bioresource technology，2016，219：270-280.

［21］WANG Q，WANG Z，AWASTHI M K，et al.Evaluation of medical stone amendment for the reduction of nitrogen loss and bioavailability of heavymetals during pig manure composting［J］.Bioresource technology，2016，220：297-304.

［22］李太魁，王小非，郭战玲，等.添加生物炭对猪粪好氧堆肥过程氮素转化与氨挥发的影响［J］.生态环境学报，2021，30（4）：874-879.

［23］WONG J W C，LI S W Y，WONG M H.Coal fly ash as a composting material for sewage sludge：Effects on microbial activities［J］.Environmental technology，1995，16（6）：527-537.

［24］郝莘政，李振国，王长虹，等.堆肥化过程中无机态氮磷钾养分的有机态转化［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（6）：68-73.

［25］周文兵，刘大会，朱端卫.不同调理剂对猪粪堆肥過程及其养分状况的影响［J］.华中农业大学学报，2004，23（4）：421-425.

［26］油畅，崔骏，李强，等.堆肥腐殖酸形成及其电化学活性［J］.环境科学研究，2021，34（12）：2980-2988.