吉兰-巴雷综合征患者外周血记忆性T细胞和记忆性B细胞亚群的变化及其临床意义

刘坛 黄小雨 张勇

[摘要] 目的 探討吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）患者外周血记忆性T细胞和记忆性B细胞亚群的变化及其临床意义。方法 选取2018年6月至2020年12月于徐州医科大学附属医院神经内科住院的16例GBS患者作为研究组，并选取同期16名来院的健康体检者作为对照组。流式细胞术检测两组入选者的外周血T细胞亚群，包括CD4+初始T细胞（naive T cells，TN）、CD4+中央记忆性T细胞（central memory T cells，TCM）、CD4+效应记忆性T细胞（effector memory T cells，TEM）和CD4+终末分化效应记忆性T细胞（terminally differentiated effector memory T cells，TEMRA）及记忆性B细胞、浆母细胞的占比并分析其临床价值。结果 与对照组相比，研究组患者的CD4+TN及CD8+TN均明显下降（P<0.05），CD4+TEM及CD8+TEM均明显升高（P<0.05），TCM及TEMRA在CD4和CD8上的比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比，研究组记忆性B细胞比例明显升高（P<0.05），两组患者间浆母细胞占比比较，差异无统计学意义（P>0.05）。GBS患者外周血CD4+TEM及CD8+TEM占比与Hughes残疾评分、脑脊液蛋白、脑脊液免疫球蛋白G及记忆性B细胞占比均呈正相关（P<0.05）。结论 GBS患者存在记忆性T细胞和记忆性B细胞亚群免疫紊乱，CD4+TEM细胞、CD8+TEM细胞及记忆性B细胞占比升高，这很可能是GBS发病过程中重要的外周免疫机制。

[关键词] 吉兰-巴雷综合征；效应记忆性T细胞；记忆性B细胞

[中图分类号] R743.3      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.013

Changes and clinical significance of memory T cells and memory B cell subsets in peripheral blood of patients with Guillain-Barré syndrome

LIU Tan1， HUANG Xiaoyu2， ZHANG Yong2

1.Department of Neurology， the First Peoples Hospital of Huzhou， Huzhou 313000， Zhejiang， China; 2.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University， Xuzhou 221000， Jiangsu， China

[Abstract] Objective To investigate the changes of memory T cells and memory B cells subsets in peripheral blood of patients with Guillain-Barré syndrome （GBS） and their clinical significance. Methods A total of 16 patients with GBS who were hospitalized in the Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from June 2018 to December 2020 were selected as the research group， and 16 healthy people who came to the hospital for physical examination during the same period were selected as the control group. The proportion of CD4+ naive T cells （TN）， CD4+ central memory T cells （TCM）， CD4+ effector memory T cells （TEM）， CD4+ terminally differentiated effector memory T cells （TEMRA）， memory B cells and plasmacytocytes in peripheral blood of the two groups was detected by flow cytometry and its clinical value was analyzed. Results Compared with the control group， CD4+TN and CD8+TN were significantly decreased in research group （P<0.05）， while CD4+TEM and CD8+TEM were significantly increased in research group （P<0.05）. There was no significant difference between TCM and TEMRA in the proportion of CD4 and CD8 （P>0.05）. Compared with the control group， the proportion of memory B cells in the GBS group was significantly increased （P<0.05）， while the proportion of plasmabytes was not significantly different. The percentages of CD4+TEM and CD8+TEM in peripheral blood of GBS patients were positively correlated with Hughes disability score， cerebrospinal fluid protein， cerebrospinal fluid immunoglobulin G and memory B cells （P<0.05）. Conclusion There are immune disorders of memory T cells and memory B cells subsets in patients with GBS. The increased proportion of CD4+TEM cells， CD8+TEM cells and memory B cells may be a peripheral immune mechanism in the pathogenesis of GBS.

[Key words] Guillain-Barré syndrome; Effector memory T cells; Memory B cells

吉蘭-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）是一类免疫介导的急性炎性周围神经病，主要病理生理机制是外周神经中抗体-抗原相互作用引起的补体介导的神经损伤[1-2]。既往研究发现体液免疫及细胞免疫共同参与此病的发生，然而国内外关于GBS免疫细胞亚群的研究尚不充分，尤其是记忆性细胞亚群在GBS患者外周血中的占比仍需进一步探讨。已有文献报道记忆性B细胞参与了GBS的发病[3]；也有学者指出记忆性T细胞可帮助记忆性B细胞更快速地产生抗体反应[4]。由此推测记忆性T细胞及记忆性B细胞均可能参与GBS的发病。本研究通过分析GBS患者记忆性T细胞及记忆性B细胞亚群的改变，为探索GBS的发病机制提供新思路。

1  资料与方法

1.1  一般资料

回顾性选取2018年6月至2020年12月于徐州医科大学附属医院神经内科住院的16例GBS患者作为研究组，其中男8例、女8例，年龄28～78岁，平均（54.38±15.24）岁。选取同期16名来院的健康体检者作为对照组，其中男7例、女9例，年龄29～69岁，平均（46.56±11.18）岁。纳入标准：①符合《中国吉兰-巴雷综合征诊治指南2019》诊断标准[1]；②年龄≥18岁；③未接受静脉注射免疫球蛋白治疗。排除标准：①其他自身免疫性疾病，如白血病、类风湿疾病、甲状腺疾病、人类免疫缺陷病毒感染的患者；②器官移植的患者；③诊断不明确或临床资料不全、资料丢失的患者。所有研究对象均签署知情同意书。本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：XYFY2020-JS019-01）。

1.2  方法

所有研究对象均于入组后空腹抽取6ml静脉血，其中2ml静脉血用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，余静脉血不抗凝直接分离血清。采用人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司）分离得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），经磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤离心后加入鼠抗人CD3-APC-Cy7抗体、鼠抗人CD4-APC抗体、鼠抗人CD8-Percp-Cy5-5抗体、鼠抗人CD45RA- V450抗体、鼠抗人CCR7-BV510抗体（美国BD公司）；同时设同型对照管，室温避光孵育15min后，流式细胞仪检测记忆性T细胞亚群，其中CD4+初始T细胞（naive T cells，TN）表型为CD3+、CD4+、CD8-CD45RA+、CCR7+，CD4+中央记忆性T细胞（central memory T cells，TCM）表型为CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7+，CD4+效应记忆性T细胞（effector memory T cells，TEM）表型为CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-，CD4+终末分化效应记忆性T细胞（terminally differentiated effector memory T cells，TEMRA）表型为CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-；CD8+TN细胞表型为CD3+、CD4-、CD8+ CD45RA+、CCR7+，CD8+TCM细胞表型为CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7+，CD8+TEM细胞表型为CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-，CD8+TEMRA细胞表型为CD3+、CD4-、CD8+ CD45RA-、CCR7-。在分离的PBMC中加入鼠抗人CD45-Percp-Cy5-5抗体、鼠抗人CD19-APC、鼠抗人CD27- BV510、鼠抗人CD38-FITC抗体（美国BD公司），同时设同型对照管。室温避光孵育15min后，流式细胞仪检测记忆B细胞亚群，其中记忆B细胞表型为CD19+ CD27+，浆母细胞表型为CD19+ CD27+CD38+。

1.3  统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验。不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（Q1，Q3）]表示，组间比较采用秩检验。计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用c2检验。采用Pearson相关性分析CD4+TEM及CD8+TEM占比与Hughes残疾评分、脑脊液蛋白、脑脊液免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）及记忆性B细胞的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  GBS患者的一般资料及外周血记忆性T细胞亚群占比分析

GBS患者的一般资料分析见表1。与对照组相比，研究组患者的CD4+TN及CD8+TN均明显下降（P<0.05），CD4+TEM及CD8+TEM均明显升高（P<0.05），TCM及TEMRA在CD4和CD8上的比例差異无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.2  两组患者的外周血记忆性B细胞占比比较

与对照组比较，研究组患者的记忆性B细胞比例明显升高（P<0.05），浆母细胞的比例差异无统计学意义，见表3。

2.3  GBS患者外周血CD4+TEM和CD8+TEM占比与GBS患者临床严重程度的相关性分析

GBS患者外周血CD4+TEM及CD8+TEM占比与Hughes残疾评分、脑脊液蛋白、脑脊液IgG及记忆性B细胞占比均呈正相关（P<0.05），见图1。

3  讨论

GBS发病与自身免疫功能障碍相关，各种类型的活化的T细胞被认为是GBS的发生和发展的协调者。研究表明记忆性T细胞对B细胞生发中心的形成及产生对抗髓鞘的抗体具有十分重要的作用，其中TEM细胞可通过产生细胞因子白细胞介素（interleukin-17，IL-17）和重组人干扰素（recombinant human interferon-r，IFN-γ）等炎症因子参与B细胞的分化[5]；同时记忆性B细胞也与GBS的发病相关[3]。因此，进一步明确记忆性B细胞亚群、记忆性T细胞亚群尤其是TEM细胞在GBS患者外周血中的占比，对解释GBS的发病机制至关重要。

有学者根据是否表达CD45RA区别初始T细胞和记忆性T细胞，并进一步依据趋化因子受体CCR7的表达将记忆性T细胞分为TCM和TEM[6]。与初始T细胞和TCM细胞相比，TEM细胞更能快速被抗原识别，迅速激活免疫反应，且可立刻到达炎症部位并发挥作用[7]。既往多项研究表明，TEM细胞与一些自身免疫性疾病如多发性硬化、系统性红斑狼疮 、结肠炎、1型糖尿病等的发生、发展、复发及严重程度密切相关[8-12]。本研究结果也显示，与对照组相比，研究组患者外周血CD4+TEM细胞和CD8+TEM细胞占比更高，差异有统计学意义。初始B细胞成熟后，与抗原相遇被其激活，随后分化为CD19+CD27+记忆性B细胞；当记忆性B细胞再次与相同抗原相遇时就会增殖，分化为浆细胞，产生特异性抗体，从而发挥介导体液免疫应答的作用。据报道，记忆性B细胞在一些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自身免疫性溶血性贫血等疾病中发挥至关重要的作用[13-15]。Wang等[3]发现记忆B细胞在GBS急性期显著增加，并随着病情的恢复而减少，进一步的Spearman相关分析显示GBS的临床严重程度与患者外周血中记忆B细胞的占比呈正相关。本研究结果与之一致，研究组患者记忆性B细胞比例高于对照组；此外，进一步Pearson相关性分析显示CD4+TEM及CD8+TEM细胞占比与Hughes残疾评分、脑脊液蛋白、脑脊液IgG及记忆性B细胞占比均呈正相关，CD4+TEM及CD8+TEM细胞与疾病临床严重程度呈正相关。在GBS发病中发挥重要作用，并可能通过自身效应功能调节B细胞的分化参与GBS的发病。

综上，本研究发现GBS患者存在记忆性T细胞和记忆性B细胞亚群免疫紊乱，外周血中CD4+TEM细胞、CD8+TEM细胞及记忆性B细胞占比升高可能是GBS发病过程中的一个外周免疫机制。进一步深入探讨TEM细胞参与GBS发病的机制有望成为治疗GBS的新靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 卜碧涛， 崔丽英， 笪宇威， 等. 中国吉兰-巴雷综合征诊治指南2019[J]. 中华神经科杂志， 2019， 52（11）： 877–882.

[2] 曹磊， 胡燕杰， 张雨欣， 等. 神经电生理检查对吉兰-巴雷综合征病程及病情的判定价值[J]. 安徽医学， 2020， 41（11）： 1258–1260.

[3] WANG Q， XING C， HAO Y， et al. Memory B cells in Guillain-Barre syndrome[J]. J Neuroimmunol， 2017， 305： 1–4.

[4] SHIMIZU T， NAGAFUCHI Y， HARADA H， et al. Decreased peripheral blood memory B cells are associated with the presence of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis： A case-control study[J]. Mod Rheumatol， 2021， 31（1）： 127–132.

[5] JAIN A， SONG R， WAKELAND E K， et al. T cell-intrinsic IL-1R signaling licenses effector cytokine production by memory CD4 T cells[J]. Nat Commun， 2018， 9（1）： 3185.

[6] 卢红娟， 孙卫民. CD4+记忆性T细胞产生的细胞学机制[J]. 现代免疫学， 2010， 30（6）： 507–510.

[7] 陈孟嘉， 冯辉. 干细胞样记忆性CD8+T细胞的生物学特性研究进展[J]. 中国免疫学杂志， 2020， 36（11）： 1403–1406.

[8] 李盈， 胡学强. 记忆性T细胞在多发性硬化发病和治疗中的作用[J]. 中華神经医学杂志， 2009， 8（3）： 319–320.

[9] HOHLFELD R， BELTRAN E， GERDES L A， et al. Tissue- resident CD8+ memory T cells in multiple sclerosis[J]. Brain， 2021， 12， 144（1）： e7.

[10] ZHANG B， WEI B， GAO M， et al. Aberrant T cell subsets and cytokines expression profile in systemic lupus erythematosus[J]. Clin Rheumatol， 2018， 37（9）： 2405–2413.

[11] 吴甜甜， 刘雪珂， 刘馥春， 等. 左金丸对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠免疫记忆性T细胞水平的调节作用[J]. 中药新药与临床药理， 2020， 31（10）： 1158–1164.

[12] 周小斌， 费小蔷， 叶军， 等. T1DM患者外周血记忆性T细胞表面PD-1表达水平与其疾病发生发展的初步研究[J]. 南京医科大学学报（自然科学版）， 2018， 38（4）： 476–481.