GC-MS/MS 法测定苹果中乙螨唑含量的不确定度评定

◎ 张丹丹，李国辉，唐德红，李 梅

（1.遵义市产品质量检验检测院，贵州 遵义 563000；2.遵义师范学院 化学化工学院，贵州 遵义 563006）

乙螨唑（Etoxazole）隶属于二苯基恶唑啉杀虫剂[1-2]，具有触杀和胃毒作用，对螨卵胚胎的形成有较好的抑制作用，还能阻碍幼螨到成螨的蜕皮过程。乙螨唑因具有活性高、持效期长、渗透力强、耐雨水冲刷等特点，对二斑叶螨、山楂叶螨、红蜘蛛、茶黄螨、朱砂叶螨等有较好防治效果[3-8]。但其在农业生产中的频繁使用会导致不同程度的农药残留。乙螨唑具有生物富集和非靶向毒性[9]，可损害人体细胞的正常生理功能[10]，在农作物上的残留量过高会给人体健康带来安全隐患。《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）[11]对苹果中乙螨唑残留限量值有明确的规定，即不能超过0.1 mg·kg-1。

一份完整的定量报告包括测量值及其测量不确定度[12-13]。测量不确定度与实验测定结果紧密关联[14-15]，在评价测量结果的准确性和可信度方面发挥着重要作用，能为测定结果提供更加科学的保障[16-17]。不确定度数值越小，说明测量结果越准确，测量结果越接近真值。因此，在实验过程中进行不确定度评定是一项必不可少的工作，不仅可以为临界值提供数据支撑，降低误判风险，还有助于实验室加强内部质量控制[18-22]。

本文根据《食品安全国家标准 植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》（GB 23200.113—2018）对苹果中乙螨唑残留量进行测定，外标法定量。同时参考测量不确定度评定及表示的相关标准[23-26]建立数学模型，对乙螨唑残留量检测结果进行不确定度评定，明确影响测定结果的主要因素，以便在日后的检验工作中对其进行优化和改进，进一步提升检验结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、乙酸乙酯，色谱纯，阿达玛斯试剂（中国）公司；氯化钠，分析纯，广东云星生物技术有限公司；硫酸镁，分析纯，天津市华盛化学试剂有限公司；柠檬酸钠，分析纯，上海普誉科贸有限公司；柠檬酸氢二钠，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；PSA，天津博纳艾杰尔科技有限公司；乙螨唑标准品：100 μg·mL-1，不确定度0.15 μg·mL-1，溶剂为甲醇，农业部农村环境保护科研监测所。

苹果，采购于遵义市任家坳农贸市场。

1.2 仪器与设备

8890-7000D 气质联用仪（EI 源），美国Agilent公司；电子天平（ME204E），瑞士梅特勒-托利多（上海）有限公司；HT-200 多管旋涡混匀仪，上海沪析实业有限公司；SIGMR 3-18KS 台式高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；YDCY-12L 水浴氮吹仪，上海熙扬仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

按照《食品安全国家标准 植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》（GB 23200.113—2018）中方法进行样品提取和净化，外标法定量。

1.3.2 标准溶液配制

准确移取乙螨唑标准品1.00 mL至25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释并定容，配成质量浓度为4 μg·mL-1的标准储备液。依次准确移取一定量的乙螨唑标准储备液，用乙酸乙酯定容，得到浓度分别为0.10 μg·mL-1、0.12 μg·mL-1、0.16 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.24 μg·mL-1的标准工作溶液。

将空白苹果样品按GB 23200.113—2018 中方法处理至氮吹近干，再分别准确加入不同浓度的乙螨唑标准工作溶液1 mL 复溶，得到质量浓度分别为0.10 μg·mL-1、0.12 μg·mL-1、0.16 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.24 μg·mL-1的基质标准工作溶液，待用。

1.3.3 仪器条件

（1）气相条件。ThermoTG-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度：300 ℃；进样体积：1 μL；载气：高纯氦气；流速：1.2 mL·min-1；进样方式：不分流进样。升温程序见表1。

表1 升温程序表

（2）质谱条件。离子源：EI 源；电子能量：70 eV；接口温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟时间：5 min。扫描方式：MRM 模式。乙螨唑定量离子对141.0/113.0，碰撞电压15 V；定性离子对141.1/63.1，碰撞电压30 V；定性离子对204.0/176.1，碰撞电压10 V；定性离子对299.9/269.9，碰撞电压20V。

1.4 数学模型

苹果中乙螨唑含量按照公式（1）计算。

式中：X为试样中乙螨唑的含量，mg·kg-1；C为依据标准曲线计算出样品待测液中乙螨唑的质量浓度，μg·mL-1；V为待测液定容体积，mL；V1为提取溶液的体积，mL；V2为分取溶液体积，mL；m为称取苹果试样的质量，g。

2 结果与分析

参考整个实验过程并结合数学模型分析，气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）测定苹果中乙螨唑含量的过程中引入的不确定度来源有乙螨唑标准溶液配制、标准曲线拟合、样品称量、样品待测液制备、测量重复性、回收率。

2.1 标准溶液配制引入的不确定度u(S)

2.1.1 标准品质量浓度引入的相对标准不确定度urel(S1)

查阅乙螨唑标物证书，标准品的质量浓度为100 μg·mL-1，扩展不确定度为0.15 μg·mL-1，按矩形分布计算，由乙螨唑标准品质量浓度引入的相对标准不确定度为

2.1.2 标准储备液配制引入的相对标准不确定度urel(S2)

标准储备液在配制过程中用到了A 级1 mL 单标线吸量管、25 mL 容量瓶。1 mL 单标线吸量管和25 mL 容量瓶对应的容量允差分别为±0.007 mL和±0.03 mL[26]。按照矩形分布考虑，，则1 mL 单标线吸量管和25 mL 容量瓶的容量允差引入的相对标准不确定度分别为

因玻璃量器（硼硅玻璃体积膨胀系数为1.0×10-5℃-1）与溶剂随温度变化而产生的体积变化相比，可忽略不计，只需考虑后者引入的不确定度。当实验室环境温度为（20±5）℃时，甲醇和乙酸乙酯的体积膨胀系数分别为1.19×10-3℃-1、1.38×10-3℃-1。依照矩形分布考虑，，则1 mL 单标线吸量管和25 mL 容量瓶因环境温度改变而引入的相对标准不确定度分别为

因此，在标准储备液配制过程中，由1 mL 单标线吸量管和25 mL 容量瓶引入的相对标准不确定度分别为

合成得乙螨唑标准储备液配制引入的相对标准不确定度为

2.1.3 试剂标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(S3)

试剂标准工作溶液配制过程中用1 mL 刻度吸量管和10 mL 容量瓶稀释并定容，不确定度按2.1.2 评定方法进行评定，不确定度结果详见表2。表2 中的各相对标准不确定度分量互不相关，则试剂标准工作溶液引入的相对标准不确定度为

表2 玻璃量器及温度变化引入的不确定度表

2.1.4 基质工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(S4)

基质工作溶液配制过程使用1 mL 单标线吸量管（A 级）5 次，不确定度参考2.1.2 评定过程。苹果空白基质溶液体积膨胀系数参考乙酸乙酯，当实验室环境温度为（20±5）℃时，基质标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度为

以上各项不确定度分量互不相关，合成乙螨唑标准溶液配制过程引入的相对标准不确定度为

2.2 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(Cal)

对空白基质配制的5 个不同浓度点的乙螨唑标准溶液进行测定，每个浓度点平行测定3 次。以乙螨唑质量浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制标准曲线方程，得到回归方程为Y=1 597 291.463C-129 7，r=0.999。乙螨唑基质标准工作液的测试数据详见表3。

表3 基质标准曲线数据表

对苹果阳性试样测定7 次，得出苹果试样中乙螨唑的质量浓度分别为0.197 7 μg·mL-1、0.196 5 μg·mL-1、0.192 6 μg·mL-1、0.198 8 μg·mL-1、0.194 8 μg·mL-1、0.193 4 μg·mL-1和0.192 9 μg·mL-1，则标准曲线引入的标准不确定度计算为

式中：S(A)为标准溶液峰面积标准偏差；Yfi为乙螨唑标准溶液不同浓度级别点峰面积实际响应值；b为标准曲线斜率；Ci为不同浓度级别乙螨唑标准溶液理论质量浓度，μg·mL-1；a为标准曲线的截距；n为乙螨唑标准溶液测定次数（5 水平×3 平行=15）；p为样品溶液平行测定次数，p=7；C0为待测试样通过校准曲线所得的浓度平均值，0.195 2 μg·mL-1；C-为不同浓度级别乙螨唑标准溶液的平均值，0.164 μg·mL-1；Cfi为乙螨唑标准溶液的实测浓度，μg·mL-1。

将表3 数据带入公式（3）中计算得S(A)=3 881.64，u(Cal)=0.001 176 μg·mL-1，则标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为

2.3 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

查看天平检定证书，其允许误差为±0.5 mg（即±0.000 5 g）。依照矩形分布计算，样品称量引入的相对标准不确定度为

2.4 样品待测液制备引入的相对标准不确定度urel(Q)

提取过程中采用10 mL 单标线吸量管移取10 mL乙腈加至样品中。A 级10 mL 单标线吸量管容量允差为±0.020 mL[26]，在（20±5）℃时乙腈体积膨胀系数为1.37×10-3℃-1，不确定度评定参考2.1.2，则10 mL单标线吸量管引入的相对标准不确定度为

分取样液时，用2 mL 单标线吸量管吸取离心上清液2 mL，A 级2 mL 单标线吸量管容量允差为±0.010 mL[26]。因此，分取过程引入的相对标准不确定度为

定容时，用A 级1 mL 单标线吸量管吸取1 mL 乙酸乙酯，则定容过程引入的相对标准不确定度为

以上3 个不确定度分量互不相关，则样品待测液制备引入的相对标准不确定度为

2.5 测量重复性引入的相对标准不确定度urel(X)

添加4 μg·mL-1乙螨唑标准储备液0.25 mL 到空白苹果样品中，按1.3.1 方法处理，进行7 次重复实验测定。样品7 次重复测定结果的标准偏差S(X)依据计算，测量重复性引入的标准不确定度为，详细测定和计算结果见表4。

表4 重复性测定结果表

样品测量重复性引入的相对标准不确定度为

2.6 加标回收率引入的相对标准不确定度urel(R)

苹果试样在前处理过程中可能会引起乙螨唑的部分损失，导致试样中的乙螨唑无法全部进入仪器进行检测。在空白苹果试样中添加一定量的乙螨唑标准储备液，加标量为0.1 mg·kg-1，按1.3.1 处理方法，进行7 次重复实验。经测定计算，回收率结果依次为98.9%、98.3%、96.4%、99.4%、97.4%、96.7%、96.4%，平均回收率为97.6%。

回收率的标准偏差为

则回收率引入的标准不确定度为

采用t检验考察平均回收率与100%之间的差异是否显著。当n=7，即自由度为6，置信概率为95%时，t(0.05,6)=2.447。当平均回收率=97.6%时，t=|100%-97.6%|/0.467%=5.14，t＞2.447，需要用回收率对结果进行修正。则由回收率引入的相对标准不确定度为

2.7 合成不确定度

苹果中乙螨唑的各个相对标准不确定度分量信息见表5，根据各分量数据结果计算乙螨唑的合成相对标准不确定度为

表5 测定过程中各相对标准不确定度分量表

苹果样品中乙螨唑残留量平均值为0.097 5 mg·kg-1，则乙螨唑合成标准不确定度为

2.8 扩展不确定度及结果表示

在95%置信概率条件下，取k=2，扩展不确定度U=u×k=0.003 62×2=0.007 2 mg·kg-1，苹果中乙螨唑含量的结果可表示为（0.097 5±0.007 2）mg·kg-1，k=2。

3 结论

本研究采用GC-MS/MS 结合外标法对苹果中乙螨唑含量进行测定，通过建立不确定度数学测量模型，对可能影响最终测定结果的不确定度分量进行分析和评价。结果发现，试剂标准工作溶液配制、基质标准工作溶液配制引入的不确定度较大，而试样称量过程引入的不确定度则较小。因此，在日常检验工作中，应根据样品的实际浓度选择适宜的工作曲线范围以及合适的量具，定期对量具进行检定校准，减小实验室环境温差波动范围等，以降低检测结果的不确定度，提升测定结果的准确性。