微生物在国产雪茄烟叶原料生产过程中的应用研究进展

章征程,柴志顺,辛永康,邢蕾,刘路路,蔡文,时向东,李东亮

1.四川中烟工业责任有限公司 雪茄烟技术创新中心,四川 成都 610101;

2.河南农业大学 国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室,河南 郑州 450046

0 引言

烟草作为我国重要的经济作物之一,其种植面积和产量在全球名列前茅,因此,烟草产业在我国国民经济中扮演着至关重要的角色,对经济发展有着重要的贡献[1]。雪茄烟的制作过程与传统卷烟差异较大,其是使用晾制、发酵后的原料直接卷制出来的天然烟草制品,吃味浓郁、醇厚、劲头大、余味较干净舒适[2]。近年来,国产雪茄烟消费群体不断扩大,对雪茄的认知和接受度不断提升,雪茄原料需求持续增加,湖北、云南、四川、海南4个主产区,雪茄烟叶调拨量逐年提升,国产原料在中高端手工雪茄配方中的占比逐渐增加[3]。但国产雪茄烟叶受气候、技术等因素的影响仍存在一些不足,如香气特征不明显、杂气重、刺激性强、均质化水平及优叶率较低等,难以保证工业企业对雪茄原料持续增长的需求[4]。微生物活动存在于雪茄烟叶的整个生产过程中,其对国产雪茄烟叶的生产品质具有重要影响[5]。近年来,研究人员致力于开展微生物在雪茄烟叶生产过程中作用的研究[6-14],发现其对雪茄烟叶化学成分的转化、烟叶最终品质的形成具有重要作用[15-19]。

因此,本文拟对雪茄微生物的主要类群,微生物在雪茄烟叶大田生长、晾制、发酵中的应用等进行综述,以期为微生物技术在国产雪茄烟叶原料生产过程中的合理利用,进而改善国产雪茄烟叶原料品质提供理论参考。

1 雪茄微生物的主要类群

雪茄微生物的主要类群包括根际微生物、叶际微生物和内生菌,在雪茄烟叶生产中均起着重要作用。根际微生物是指在根系周围土壤中发育和繁殖的微生物,与植物根系紧密联系[20]。樊俊等[21]对感染青枯病雪茄烟株根际土壤微生物群落进行研究,发现发病土壤微生物多样性和复杂程度提升,朱氏杆菌属(Chujaibacter)的相对丰度是致病的关键因子。范龙龙等[22]在施用咖啡豆残渣有机肥后,对雪茄烟株根际土壤真菌进行研究,发现该有机肥料可以改变雪茄烟株根际真菌群落组成,降低其α多样性及镰刀菌属、明梭孢属的相对丰度,显著增加曲霉属、圆酵母属和被孢霉属的相对丰度。因此,可以通过调节根际土壤微生物群落来促进雪茄烟株生长和防治病害。

叶际微生物是指直接附着在植物叶片表面的微生物[23]。L.Xing等[24]研究发现,雪茄烟叶叶际细菌中占优势的菌门为变形杆菌门和蓝杆菌门,Limnobacter、罗尔斯通氏属(Ralstonia)、未识别的蓝杆菌属和短波单胞菌属(Brevundimonas)为优势细菌属,不同地区雪茄烟叶叶际细菌群落的α多样性有一定的差异,但不同地区和不同烟草品种雪茄烟叶叶际细菌群落β多样性差异不大,叶际细菌群落变化会影响雪茄烟株的生长发育和抗病能力。有研究[25]表明,雪茄烟叶优势叶际真菌属分别是桑帕氏酵母菌属(Sampaiozyma)、枝孢属(Cladosporium)、尾孢菌属(Cercospora)、红菇属(Russula)、链格孢属(Alternaria)、被孢霉属(Mortierella)、假尾孢属(Pseudocercospora)、子囊菌属(Archaeorhizomyces)、赤霉属(Gibberella)和黑团孢属(Periconia),上述真菌的存在能引发腐烂病[26]、赤星病[27]、蛙眼病[28]等烟草疾病,严重降低雪茄烟叶产量和品质。研究并有效控制致病叶际真菌,对减少雪茄烟株病害具有正向作用。

植物内生菌是一种在健康植物内部生活的微生物,与植物形成共生关系,对植物的健康和生长发育有着重要影响[29]。相关研究[30]发现,在烟草的根、茎、叶中存有多种内生菌,且在不同烟草品种中具有一定的差异。吴巧茵等[31]从优质雪茄烟叶内生菌中筛选出可降解β-胡萝卜素的菌株根瘤菌属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)和鞘氨醇杆菌属(Sphingomonas),将其接种到烟叶发酵过程中,可以明显提高雪茄烟叶中类胡萝卜素降解产物含量,且发酵后烟叶的香气质、香气量、刺激性和杂气指标也得到明显改善。烟株与部分内生菌共生或互生,环境条件和宿主基因类型决定内生菌的遗传多样性[32]。植物内生菌对宿主植物具有固氮作用,能将空气中的氮气转化为可供植物利用的形式;也能够促进宿主根系生长、增加根系吸收营养的能力[33];此外,还能够促进植物生长激素的合成[34],提高雪茄烟株生长的适应能力。

微生物在雪茄烟叶生产过程中具有重要作用,其中根际微生物与叶际微生物能够改良植烟土壤结构、提高土壤养分进而促进雪茄烟株的生长和发育,还能够控制致病菌进而减少雪茄烟株病害,使烟叶感官品质得到提升。但由于内生菌难以培养、相对丰度较低且生长十分缓慢,目前大量内生菌尚未被发现[35-36]。未来,应持续探究雪茄烟叶内生菌的作用机制,进一步分离和筛选有益内生菌并应用于雪茄烟叶生产过程,以提升国产雪茄烟叶原料品质。

2 微生物在雪茄烟叶大田生产过程中的应用

在大田生产过程中,有些烟农为保障雪茄烟叶的产量,会大量施用化肥、农药,烟叶中的农药残留会导致雪茄烟叶品质普遍降低。作为生态系统中的分解者和消费者,微生物在维持生态平衡方面起着不可或缺的作用。合理利用微生物代谢产物及其底物作为雪茄烟叶大田生产的肥料和绿色农药,能够改良雪茄烟田土壤、降解有害有毒物质,并能实现健康可持续的农业生产。

2.1 微生物肥料

微生物肥料是一种微生物活动的代谢产物及其底物的混合制品,会对农作物产生特定的肥料效应,通常也被称作菌肥。微生物肥料通过调节微生物的生命运动和其产物来抑制病害,使植物的营养条件得以改善,同时使土壤潜在的肥力得以发挥[37]。微生物肥料的主要作用包括对磷、钾的解析和固氮。适当的钾含量能够提高雪茄烟叶的燃烧性能,改善雪茄烟叶颜色、厚度和吸湿性能。钾细菌是一类硅磷酸盐细菌,具有将钾矿物中的难溶态无效钾转化为可溶态有效钾的能力,在提高土壤肥力、改善作物品质方面效果显著[38],可用于改良雪茄植烟土壤。植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR)主要通过抑制土壤中有害生物和土传病原菌来增强植株的抗病能力[39],在雪茄烟叶种植过程中施用PGPR,能有效提高雪茄烟株的抗病性,进而提高雪茄烟叶的产量和品质[40]。土壤真菌是重要的植物病原菌,相关研究[41]发现,提高有机肥施用量能促进细菌和放线菌群落繁殖速度,抑制雪茄烟田土壤真菌群落数量,改善植烟土壤的微生物环境,从而减少因真菌引起的病害,促进雪茄烟叶生长。

根据已有研究[42],微生物肥料在禾谷类作物上应用最为广泛,能明显改善作物品质。微生物肥料对土壤氮素养分供应具有一定影响,能促进烟草氮素吸收利用,降低烟叶烟碱含量,提高烟叶品质[43]。微生物肥料应用于烟草生产能有效促进其生长发育,提高上等烟比例,并有效改善香吃味[44]。未来将探索微生物肥料在雪茄烟叶种植中的应用潜力,并寻找有效的微生物肥料组合,开发适用于雪茄烟叶生产的专用微生物肥料以提高其产量和品质。

2.2 微生物农药

微生物农药是利用微生物技术研究开发的一类具有杀虫和防病作用的制剂,具体包括微生物杀虫剂、杀菌剂、抗生素等[45]。目前,对烟草疾病的防控研究已经取得了明显进展,一些微生物农药已经商业化,并开始在雪茄烟田中使用。如宁南霉素(Ningnanmycin)是一种来源于诺尔斯放线菌西昌变种菌株(Streptomycesnourseivarxichangensis)的代谢产物,该微生物产物对烟草花叶病毒病有良好的防治效果[46]。放线菌发酵液提取物中存在具有烟草黑胫病菌抑菌活性的物质,据此可开发一种微生物农药,提供一种新的烟草黑胫病防治选择[47]。孢链霉菌AM6(StreptomycesglobispotusAM6)的代谢拮抗产物对烟草赤星病表现出较好的防治效果[48]。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)能产生α、β、γ、σ毒素,这些毒素具有“胃肠毒”作用,病虫摄食后会中毒或死亡[49]。此外,我国已开始利用核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Viruses)防治烟草斜纹夜蛾等害虫[50]。上述微生物农药已经广泛应用于湖北、云南、四川、海南等国产雪茄烟叶原料主产区。

随着微生物技术研究的不断深入,利用有益微生物及其代谢产物防治雪茄烟株病害已经表现出良好的前景。深入研究不同微生物种类、菌株的毒力成分和应用特性,开发更多针对雪茄烟病虫害的生物防治微生物农药并推动其大规模生产和应用,可减少对化学农药的依赖,使病虫害防治更加环保且可持续地发展。

3 微生物在雪茄烟叶晾制中的应用

人为供热或在自然条件下为晾烟提供一定的温湿度,促进烟叶发生必要的生理生化变化,使烟叶变色、干燥,这种方法称作晾制[51]。烟叶晾制期间,不同微生物类群的数量会受环境因素的影响,表现出不同的变化趋势[52]。有研究者在对白肋烟晾制期间的细菌进行分离时,发现不同晾制时期的主要细菌类群有所不同,细菌含量在晾制过程中呈下降趋势[53],但目前国内外还尚未见有关雪茄烟叶晾制过程中微生物作用机制的相关报道。雪茄烟叶与白肋烟叶晾制过程中温湿度和颜色变化类似,可推测雪茄烟叶晾制过程中微生物的活动规律可能与白肋烟叶相似。在晾制期间,微生物还能对烟草特有的亚硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines, TSNAs)的积累情况产生影响。雪茄烟叶晾制过程中TSNAs含量的升高,会在抽吸时对人体健康产生不利影响[54],而祝明亮等[55]发现,从白肋烟中筛选接种的内生细菌可以降低其中的TSNAs含量。尽管微生物可能在雪茄烟叶晾制过程中发挥至关重要的作用,但是仍需要后续的相关研究来证实。

雪茄烟叶晾制过程中微生物资源丰富、代谢功能复杂,但目前有关雪茄烟叶晾制过程中微生物作用机制的研究非常欠缺,因此在保证晾制过程温湿度适宜的情况下,探索微生物的作用机制,筛选优势菌属,对优化雪茄烟叶晾制工艺、改善烟叶品质有积极作用。

4 微生物在雪茄烟叶发酵中的应用

雪茄烟叶的发酵处理是其晾制过程的延续,为确保雪茄烟叶具有更好的品质和特性,通常需要经过一次以上的发酵处理。发酵后的烟叶颜色会变深,杂气有所下降,余味更加舒适,燃烧性更好,整体品质得到改善,这也是工业企业重视烟叶发酵的原因。微生物在雪茄烟叶发酵过程中参与了复杂的生化反应[56],对发酵过程具有促进作用。关于微生物促进烟叶发酵假说首先由小什列普格[57]提出,研究者[58],随后也发现,微生物在雪茄烟叶发酵过程中的表现特别活跃,微生物的活动和发酵过程及发酵品质之间存在密切的关系。

4.1 主要微生物群落变化

目前,很多学者已经对雪茄烟叶发酵过程中微生物群落结构进行了系统性的研究[59-66],其中主要的微生物群落见表1。由表1可知,随着发酵的进行,微生物数量降低,群落结构更加多样化,常见的细菌属为葡萄球菌属(Staphylococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus),真菌属为曲霉菌属(Aspcrgillus),不同产地和品种雪茄烟叶的微生物群落结构存在显著差异。

4.2 微生物介质作用

将微生物作为发酵介质添加到雪茄烟叶中,会对其微生物群落的生长代谢、生物化学反应途径产生影响,进而可调控有利代谢物的积累[7]。在湖北十堰楚雪-14雪茄烟叶中添加不同的发酵介质,有利于丰富发酵第0～28 d的细菌群落多样性及发酵7～28 d的真菌群落多样性,对细菌门类总体影响不大,但能够延缓细菌群落的演替速度,真菌群落的变化可以改变发酵过程中化学成分的代谢进程[7]。发酵介质的添加同时可以降低曲霉属(Aspergillus)的相对丰度,将曲霉属中部分菌种的相对丰度控制在霉变临界值以下,这有利于调控雪茄烟叶的霉变速度[7,67]。

在发酵过程中添加微生物能够提高雪茄烟叶的香气和吃味[68]。从晾制后的雪茄烟叶表面筛选出菌株并应用于雪茄烟叶的发酵过程中,可以有效改善发酵后雪茄烟叶的品质[69-74]。雪茄烟叶发酵过程中添加的微生物及其作用见表2。由表2可知,微生物介质的添加能够降低发酵后烟叶中淀粉、蛋白质、纤维素等大分子物质的含量,实现提升香气成分含量、改善烟叶品质的效果。

4.3 微生物防霉

霉变是雪茄烟叶发酵过程中常见的问题,适宜环境条件下易滋生霉菌[75],这会导致烟叶组织结构被破坏,产生霉腐臭味,影响雪茄烟叶品质[76]。减少烟叶霉变的发生对烟叶经济性状的提升和烟叶品质的改善有促进作用。生物防霉法是目前防霉变研究的热点,其主要原理是利用微生物或其代谢产物抑制或杀死霉菌,以预防和控制烟叶霉变。芽孢杆菌属(Bacillus)可以有效抑制霉菌的生长和繁殖[77]。宋嘉宝等[78]鉴定出引起海南雪茄烟叶霉变的微生物分别是篮状菌属(Talaromyces)、帚霉属(Scopulariopsis)和曲霉属(Aspergillus),由此筛选得到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)两种防霉变拮抗菌株,且其防霉效果较好。张岱源等[79]从湖北十堰和宜昌雪茄烟叶中分离纯化得到产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、聚多曲霉(Aspergillussydowii)、云南木霉(Trichodermayunnanense)、绳状篮状菌 (Talaromycesfuniculosus)和黑曲霉(Aspergillusniger)5种霉菌,并发现了解淀粉芽孢杆菌DY-9菌悬液(109CFU/mL)对雪茄烟叶的防霉效果最佳。

发酵过程中微生物群落结构逐渐多样化,微生物介质的添加使发酵后烟叶的常规化学成分和香气物质得以改善,同时能够减少烟叶发生霉变。但目前有关微生物介质添加的研究多集中于微生物的筛选,较少涉及其机理的探究,后续可通过组学方法深入研究微生物介质如何使雪茄烟叶提质增香。

表1 雪茄烟叶发酵过程中的主要微生物群落Table 1 Main microbial communities during the fermentation process of cigar leaves

5 结论与展望

本文综述了雪茄微生物的种类及其在大田生产、晾制、 发酵等环节应用的研究现状和面临的主要问题。指出:雪茄微生物类群分为根际微生物、叶际微生物和内生菌,其中根际微生物与叶际微生物可促进雪茄烟株的生长和发育,减少雪茄烟株病害,从而提升烟叶感官品质;但涉及内生菌的研究较为欠缺,有益内生菌的分离及筛选仍迫在眉睫。微生物广泛存在于雪茄烟叶大田生长、晾制、发酵的生产环节中,在雪茄烟叶生产过程中起重要作用。雪茄烟叶大田生长过程中,可以通过改变雪茄烟叶根际土壤真菌群落来促进雪茄烟株生长,微生物肥料、农药在雪茄烟叶大田生长环节中非常重要,但雪茄烟株专用微生物肥料、农药还未得到大面积推广和应用。在雪茄烟叶晾制过程中,微生物资源丰富、代谢功能复杂,但微生物作用机制的相关研究涉及较少。在烟叶发酵过程中,微生物群落结构逐渐多样化,在烟叶表面添加微生物介质来进行发酵,可以促进烟叶中淀粉、蛋白质、纤维素等大分子物质的降解,使烟叶化学成分更加协调,香气物质含量增加,烟叶的感官品质得以改善,烟叶的工业可用性得以提升。在预防烟叶霉变方面,可以利用微生物拮抗作用,将雪茄烟叶曲霉属的相对丰度控制在临界点以下,以减少烟叶霉变带来的经济损失。

目前,微生物在国产雪茄烟叶原料生产过程中的研究主要集中在发酵过程,而晾制是雪茄烟叶生产过程中承上启下的重要环节,微生物在该过程中也扮演着重要角色,但目前有关该阶段的研究涉及较少。因此,探索雪茄烟叶晾制过程中微生物的作用机制具有重要意义。未来,可在雪茄烟叶内生菌筛选利用、晾制过程微生物的变化等方面开展深入研究,探索雪茄烟叶晾制过程中不同阶段微生物群落的变化及其对烟叶品质的影响;还可以结合组学方法深度挖掘数据,从雪茄烟叶基因转录和信号传导方面进行深入研究,以更全面地了解微生物在雪茄烟叶晾制过程中的作用机制,为国产雪茄烟叶晾制工艺提供技术支持,为提高优质国产原料生产能力、减少对进口雪茄烟叶原料的依赖奠定基础。