罗非鱼链球菌检测方法研究进展

胡毅军，丁文桂，黄洁莹，罗 律，赖 颖，王自强，李 敏，张险朋

（1.东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086；2.广东海大畜牧兽医研究院有限公司，广东广州 511400）

水产养殖技术的发展极大刺激了内陆水域鱼类养殖产量的增长。据联合国粮农组织（FAO）统计：从1990年到2020年全球水产养殖年产量增长了609%，年均增速为6.7%，总产量达8 800万t[1]。自1991年起我国罗非鱼养殖总量一直高于全球其他国家产量的总和，到2021年罗非鱼产量达到166.26 万t，约占全球产量的1/3。罗非鱼养殖业在蓬勃发展的同时也遭受到各种病原体的威胁，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等，其中细菌引起的死亡率最高[2-3]，严重影响了罗非鱼养殖业的健康发展。罗非鱼链球菌病已被公认为是威胁全球水产养殖业的最重要疾病之一，在世界范围内广泛分布。近年来，罗非鱼链球菌病发病率明显增加，造成的经济损失逐渐增大，2019年仅给亚洲国家就造成高达5 亿美元的经济损失[1]。无乳链球菌和海豚链球菌是罗非鱼链球菌病的主要病原。目前，针对这两种病原的检测方法主要有细菌分离培养鉴定、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析法（CICA）以及普通PCR、实时荧光PCR、微滴式数字PCR（ddPCR）。本文从病原学、免疫学和分子生物学方面，综述了罗非鱼链球菌检测方法的研究进展和应用情况，分析各种检测方法的优缺点，以期为更好地预防和控制罗非鱼链球菌病提供参考。

1 细菌分离培养鉴定

传统上，无乳链球菌和海豚链球菌的检测是基于病原体分离和生理生化特征鉴定来实现的。在流行病学调查中，主要选择死亡或垂死的鱼，将其解剖后从脑、肾脏、肝脏、脾脏等器官少量取样，然后接种于选择性增菌肉汤培养基中（如加入庆大霉素、萘啶酸和绵羊血的Todd-Hewitt 肉汤培养基，或者加入黏杆菌素和萘啶酸的Lim 肉汤培养基），在35～37 ℃条件下培养18～24 h[4]。但竞争性生长研究[5]发现：无乳链球菌和海豚链球菌浓度低于6×102CFU/mg（低于水中总细菌浓度，水族箱2.27×104CFU/mg、池塘6.68×103CFU/mg）时，将难以精准分离到目标菌；组织样品中如果存在粪肠球菌等，就会抑制选择性肉汤中无乳链球菌或海豚链球菌的生长，导致传代后培养物检测为阴性，检出率大幅降低。为避免这种假阴性结果，在接种选择性肉汤培养基增菌前，可以在血平板、选择性血平板（添加新霉素和萘啶酸或黏菌素和萘啶酸的血平板）、Granada 固体培养基或显色固体培养基上划线，35～37 ℃条件下培养（Granada 平板需厌氧环境）24～48 h 后再检查菌落[6]。如果观测到目标菌落，则可以将其接种于选择性肉汤培养基中增菌，从而缩短分菌时间，增加分菌率。扩增培养过夜后，应再次接种到固体培养基上传代，直至细菌分离性状稳定，以备后续检测。

近年来，用于分离、检测致病菌的显色培养基发展迅速，主要通过在培养基中添加与吲哚基显色剂相连的酶底物来实现。在有氧环境下，吲哚分子氧化和二聚化形成靛蓝染料，沉淀在菌落中[6]。经过几十年研究已有几款用于无乳链球菌检测的商用显色培养基上市，包括bioMérieux 公司生产的ChromID Strepto B、Bio-Rad 公司生产的StrepB Select、Oxoid 公司生产的Brilliance GBS 以及CHROMagar 公司生产的CHROMagar StrepB 等。由于显色底物的存在，配制好的培养基在储存过程中须尽量减少光照，且须在黑暗中进行培养，否则分离株的显色结果将不可靠。显色培养基为无乳链球菌和海豚链球菌的分离提供了一种相对快速简便的方法，但这种方法不具备良好的特异性和敏感性。实际应用中，如果临床样品中存在其他种类的链球菌，如牛链球菌、猪链球菌、唾液链球菌、化脓性链球菌，以及肠球菌属和葡萄球菌属的部分菌种等，则都可以形成和无乳链球菌或海豚链球菌相似的显色菌落，从而出现假阳性可能。因此，为避免假阳性，在使用显色培养基的同时，仍须通过生理生化试验和分子生物学检测方法来完成最终判定。

完善的生理生化特征试验一直是临床鉴定细菌的基石。如今已经开发出将多个常规表型测试集成到单个程序中的各种测试系统，如鉴定链球菌的快速生化鉴定盒（bioMérieux 公司生产的API Rapid Strep 鉴定试剂盒和Remel 公司生产的RapID STR 试剂盒）和自动细菌鉴定系统（API 20 Strep、API CH 50、Rapid Strept 32 以及Vitek 等）。在对各项生理生化试验结果判定后，结合鉴定系统中拟定的特征，生成一个生物型编号，再将编号与数据库匹配，识别细菌种类。然而，这些系统识别微生物的能力取决于数据库的准确性及物种覆盖度。尽管这些试剂盒和系统可用于鉴定无乳链球菌和海豚链球菌，但也并非100%准确。就无乳链球菌和海豚链球菌而言，因其表型相似，可能导致错误识别，且检测时间长，从分离到生理生化鉴定至少需3～5 d。

2 免疫学方法

免疫检测技术是利用特异性抗体或细胞免疫反应等生物学特性，对病原、药物、生物标志物等进行检测的技术。现代免疫学技术通过引入酶催反应、荧光或同位素标记等作为抗原抗体特异性结合的特异性指标，使灵敏、快速的诊断检测技术建立成为可能，并发展出多种免疫学检测方法。免疫检测技术在人类医学以及兽医、水产及其他领域应用广泛，如临床诊断、抗体检测、药物研发、食品安全检测、环境监测等方面。

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA 是基于酶催化反应来提高抗原抗体特异性结合的一种高敏感性免疫测定技术，被广泛用于多种病原微生物检测，是过去几十年最成功的检测技术之一。无乳链球菌间接ELISA 检测方法[7-8]，是以鱼源无乳链球菌为抗原，通过免疫兔获得的高效价多克隆抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG 作为酶标二抗，将待检组织样品经匀浆反复冻融后用于检测，其抗原最佳包被浓度为l06CFU/mL，最低检测限为103～104CFU/mL，在发病罗非鱼中的病原检出率为80%～100%，在无症状带菌罗非鱼组织中的病原检出率为0～50%，其中脾脏中的检出率高于脑和肝脏。但也有报道[9]称，罗非鱼无乳链球菌双抗体夹心ELISA 检测方法灵敏度仅为0.85×106CFU/mL，不能满足实际样品的检测需求。目前针对无乳链球菌和海豚链球菌的研究中，ELISA 技术更多的是被应用于宿主特异性抗体水平评价[10-13]和蛋白鉴定[14-15]，而不是直接针对抗原的检测。间接ELISA 检测方法具有特异性强、操作简便、费用低，以及对检测仪器及试验人员技术要求低等优势，但因其发展晚、灵敏度不高、前处理繁琐等，还不是当前主流的检测方法，仍有发展推广空间。

2.2 胶体金免疫层析法（CICA）

CICA 是20世纪80—90年代，在ELISA、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上开发出的，一种基于胶体金颗粒及抗原与抗体相互作用的快速免疫检测方法。它结合了免疫反应和色谱层析原理，用于检测特定物质（通常是抗原或抗体）的存在与否，因其具有操作方便、检测时间短、裸眼即可观察结果等优点，在临床诊断、抗体评价及药物残留检测等领域得到广泛应用。2017年Wu 等[16]开发了一种针对于罗非鱼无乳链球菌的胶体金免疫层析条，用于快速检测罗非鱼无乳链球菌感染。该研究将获得的无乳链球菌单克隆抗体4C12 和3A9 分别作为胶体金单克隆抗体偶联物和捕获抗体，用于特异性检测无乳链球菌。该方法允许用于养殖场所，灵敏度为1.5×104CFU/mL，测定时间少于15 min，是当前相同灵敏度中的最方便快捷的检测方法，具有一定的实际推广应用价值，但其灵敏度仍有待提高。周雅[17]基于夹心法免疫结合原理，建立了海豚链球菌胶体金层析试纸条检测法。免疫Balb/c 雌鼠后，将其脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0 进行电融合，经筛选和亚克隆得到单抗分泌细胞株6C11 和6G8；后以单抗6C11 标记胶体金，单抗E1H8 包被检测线，建立了胶体金试纸条系统。该方法检测限可达2×105CFU/mL，但在对6 株常见鱼类致病菌的特异性试验中发现，对3 株革兰氏阳性菌也呈现阳性，因而其特异性并不强，仍然需要进一步完善。

3 分子生物学检测方法

随着新技术的发展和应用，对病原微生物的研究已从常规的病原学分离鉴定深入到分子生物学水平，基于分子生物学的无乳链球菌和海豚链球菌检测方法陆续被建立。分子生物学检测方法既可以定性，也可以定量，甚至可以区分菌的血清型或判断毒力因子基因的有无。

3.1 普通PCR 方法

PCR 方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、操作简便等优点，可在短时间内进行快速准确的病原学诊断。近年来，PCR 方法已被广泛应用于无乳链球菌和海豚链球菌检测，并取得了显著进展。Mata 等[18]开发了基于海豚链球菌乳酸氧化酶基因（lctO）的PCR 检测方法。该方法可快速、特异地检测不同样品中的海豚链球菌，其扩增产物为870 bp，检测限为（31～62）×103CFU/mL。该研究还证实了lctO基因是开发海豚链球菌PCR 检测方法的合适基因靶标。Zhou 等[19]通过对海豚链球菌10 个分离株和1 个参考菌株（ATCC29178）的16S—23S rRNA 基因间隔区（ITS）进行测序和比对，设计了用于检测海豚链球菌的PCR 引物。该方法检测固体培养基、肉汤培养物或受感染鱼组织中的海豚链球菌。过去针对无乳链球菌的PCR检测方法多用于乳制品和人类样品检测，但其许多引物会与海豚链球菌发生交叉反应，因而不能满足水产养殖业的需求。Cui 等[20]根据无乳链球菌和海豚链球菌ITS 序列的差异设计PCR 引物，建立了能够同时检测和区分罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的PCR 方法，但由于普通PCR 方法的局限性，其检测限仅能达到105CFU/mL。在最近的研究中，Leigh 等[21]基于无乳链球菌的groEL2基因设计引物建立了PCR 方法，其对分离自鱼类以及陆地和水生哺乳动物的97 个无乳链球菌分离株都可实现目标片段的有效扩增，且与10 株海豚链球菌和其他22 个相近菌株无交叉反应，解决了水产养殖中无乳链球菌和海豚链球菌感染鱼类临床症状相似、基因组高度相似、引物特异性差、实验室检测难以区分等问题。

3.2 多重 PCR 方法

多重PCR 又称多重引物PCR，是在常规PCR基础上发展起来的一种技术，其在一个PCR 体系中加入多对特异性引物，可同时扩增不同的DNA片段，能同时快速检测多种病原体或不同的细菌血清型，大大提高了检测效率，节省了人力、物力和财力。为方便大规模调查与养殖鱼类疾病有关的细菌，并评估这些致病菌对养殖鱼类的影响程度，Diyie 等[22]建立了可同时检测海豚链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和柱状黄杆菌等6 种致病菌的多重PCR 检测方法，发现14.9%的罗非鱼存在这6 种菌的混合感染，其中海豚链球菌检出率最高（88%），无乳链球菌次之（72%）。多重PCR 技术不但可以同时检测多种病原体，也能实现细菌多种血清型的分型和多重毒力因子基因的检测。为将泰国罗非鱼养殖场分离的无乳链球菌进行生物分型，并研究细菌血清型与毒力之间的相关性，Kannika 等[23]建立了14 种毒力基因的多重PCR 检测方法，可用于预测分离株致病性并跟踪其感染趋势，另外还建立了黏附型、入侵型和免疫逃逸型3 种毒力基因类别的多重PCR 分型方法，可用于预测无乳链球菌的致病性。

3.3 实时荧光PCR 方法

实时荧光PCR 技术不仅具有传统PCR 扩增效率高的特点，而且具有特异性高、灵敏度高、精度高等特点。目前实时荧光PCR 技术已被广泛应用于各类病原微生物的检测，同时还可以解决免疫学检测的“窗口期”问题，判断感染是处于潜伏期还是亚临床阶段。此外，实时荧光PCR 可以定量检测不同组织中的病原体，这是血清抗体检测方法无法做到的。Su 等[24]根据16S—23S rRNA 基因间隔区片段设计了1 对引物IGS-s/IGS-a，建立了用于检测无乳链球菌的实时荧光PCR 检测方法，可用于调查受感染鱼的细菌组织嗜性，以及监测恢复期鱼的细菌定殖。相较于传统微生物分离鉴定方法（金标准）和普通PCR 方法，实时荧光PCR 方法优点突出。Ferreira 等[25]对在母体定殖的无乳链球菌检测方法对比研究中发现，金标准检测的定殖率为3.8%，普通PCR 为17.7%，而实时荧光PCR为29.2%。与金标准和普通PCR 方法相比，实时荧光PCR 检测方法具有更好的性能，更适用于常规筛查，是新生儿无乳链球菌感染的有效筛查方法。He 等[5]在对华南罗非鱼主产区链球菌病的流行病学调查中，共采集了387 条罗非鱼样本，其中疑似健康24 条、垂死35 条、死鱼328 条，对这3种样本，细菌分离鉴定检出率分别为0、100%和94.82%，而实时荧光PCR 检出率分别为0、100%和98.78%。目前针对海豚链球菌的实时荧光PCR检测方法研究较少，2021年研究者首次对该方法的特异性、适用性、灵敏度、再现性和效率进行了验证，证实实时荧光PCR 方法可作为海豚链球菌实验室检测的一种准确和灵敏的常规检测方法。丁文桂等[26]根据罗非鱼无乳链球菌的Sip基因和海豚链球菌的LysR基因建立了双重荧光PCR 方法，发现无乳链球菌和海豚链球菌的最低检测限分别为29.6 和10.7 CFU/mL，与水生动物疫病常见病原没有交叉反应，与细菌分离培养鉴定方法的符合率为100%，可以同时检测和鉴别罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌。

3.4 环介导等温扩增方法（LAMP）

LAMP 是日本学者Notomi 于2000年开发的一种核酸扩增技术，因其简单、快速且无需昂贵的试剂和设备而受到广泛关注[27]。Zhou 等[28]使用标记有双功能探针的金纳米粒子（AuNP）和LAMP技术相结合建立了海豚链球菌LAMP-AuNP 检测方法。该研究基于AuNPs 自聚集和与配体生物偶联的特点，使结果可以通过颜色变化实现肉眼观察，并与LAMP 扩增法串联，使检测方法具有高灵敏度和易操作的特点；同时，对双探针的改进充分利用了LAMP 方法的特性，使该检测方法的结果得到了稳定展示。该方法最低检测限为102CFU/mL，与普通PCR 方法和AuNPs 检测试纸条相比，其灵敏度更高，检测时间少于2 h，且不需要PCR 扩增仪，检测人员在鱼塘边即可进行方便快捷的检测。Pepey等[29]采用FTA 洗提卡和LAMP 技术相结合的方式，建立了罗非鱼无乳链球菌FTA-e/LAMP 检测方法。该方法包括两个主要步骤：首先使用FTA 洗提卡提取DNA，随后对提取的DNA 进行LAMP 反应。该方法的体外灵敏度为1.9×102CFU/mL，但在特异性方面无法有效区分无乳链球菌和停乳链球菌，仍需优化。另外，该方法不能确定反应的终点，无法做到定量检测，并且容易受到污染而造成假阳性。

3.5 微滴式数字PCR 方法（ddPCR）

ddPCR 是在实时荧光PCR 方法基础上发展起来的新一代技术，可用于目标核酸的绝对定量。在微滴生成器中，反应体系被分隔成10 000～20 000个油包水微滴来充当PCR 反应室，每个反应室都有目标核酸的0 个或1 至多个拷贝。每个液滴都是一个特定的封闭区域，可防止反应室之间的交叉污染。目前较成熟的划分样品方法，除微滴式外还有微孔式、微流体室[30]等。微滴生成后进行常规PCR 扩增，最终通过类似于流式细胞仪的微滴读取仪单独分析液滴是否含有荧光，并依据泊松分布原理确定目标基因拷贝数。目前商品化的ddPCR 系统已被应用于临床，例如BioMark HD dPCR、OpenArray、QuantStudio 12K Flex dPCR、RainDropTM、Bio-Rad QX200TMDroplet Digital 以及NAICATM 等。ddPCR 技术在兽医领域已有广泛应用[31-32]，但在鱼类疫病病原体检测中应用较少。Zhao 等[33]基于ddPCR 技术建立了罗非鱼细小病毒（TiPV）ddPCR 快速定量检测方法。该方法最佳退火温度为59.3 ℃，引物和探针的最佳浓度分别为900 和250 nmol/L，且具有高特异性和灵敏度。验证试验发现，ddPCR 检出限（0.07 copies/μL）和临床样品阳性检出率（32%）均优于实时荧光PCR 方法（4.63 copies/μL，18%）。李敏等[34]选择hypothetical protein 编码基因设计引物探针，建立了TiLV RT-ddPCR 检测方法，其检测限可低至2 copies/μL，且与其他5 种常见的水生动物病毒无交叉反应。张险朋等[35]首次应用数字PCR 技术建立了针对罗非鱼无乳链球菌的ddPCR 方法，其最低检测限达2.56 copies/μL，与实时荧光PCR 方法相比具有更高的灵敏度，在梯度稀释至低浓度时仍有良好线性关系，且可做到精准定量，更适用于罗非鱼无乳链球菌感染的早期检测，以及鱼苗、种鱼、鱼肉产品、鱼塘环境中微量罗非鱼无乳链球菌的检测。但ddPCR 方法的应用也受到了其固有缺点的影响：应用泊松分布分析结果时，ddPCR 检测模板浓度上限受到了液滴数量的限制，因此当模板浓度高时需要适当稀释以获得准确数据；ddPCR 检测方法所需设备和试剂价格昂贵，较少有检测实验室和研究机构能够负担得起。在后续研究中可以尝试将更多的罗非鱼细菌病病原体纳入反应体系，实现一次PCR 程序检测多种病原体，以降低检测成本。

4 展望

本文通过综合阐述，深入探讨了罗非鱼链球菌检测方法的研究进展，特别关注了分子生物学、免疫学等领域的技术创新。这些新方法的不断涌现为罗非鱼链球菌病的快速、准确诊断提供了强有力的技术支持。不过不同的检测方法因其优缺点不同，有着不同的应用场景，因此了解其特点后根据具体需求选择合适的检测技术，将更有意义。这些方法的建立，对于罗非鱼健康养殖，保障渔民利益，促进地区经济发展有着重要应用价值。

尽管罗非鱼链球菌检测方法研究取得了显著进展，但仍然有一些挑战需要克服。首先，需要进一步提高方法的灵敏度、特异性以及多重检测等性能，以便更早地检测到感染，减少疫情传播。其次，应用这些方法需要得到更多的实验室以及技术支持，因此推广和普及这些技术对于各种规模的养殖场至关重要。再次，对于海豚链球菌的检测方法研究相对较少，因此还有很多工作需要做。最后，也需要继续研究罗非鱼链球菌的抗药性和毒力机制，以更好地应对由其导致的潜在流行病威胁。总之，罗非鱼链球菌检测方法仍然需要不断地研究和创新，以确保罗非鱼养殖业的健康和持续发展。希望未来的研究能进一步完善这些方法，为罗非鱼链球菌病防控提供更多有效的技术支持。