转录因子MhGL3对薄荷表皮毛发育的影响

2024-03-13陈志峰谭国飞

西南农业学报 2024年1期

陈志峰,罗庆,谭国飞

(1.遵义师范学院生物与农业科技学院,贵州遵义 563006;2.贵州省园艺研究所,贵阳 550006)

【研究意义】薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)为唇形科主要香料蔬菜作物之一,可作为香料蔬菜食用,也可用于提取薄荷精油[1]。生产上,薄荷主要以根、茎作为繁殖材料,能够保持薄荷性状一致[2-3]。然而,薄荷种植过程中经常出现品种退化,呈现植株纤细、颜色不均一、抗病性差及植株表皮毛增多等非种植品种特有性状[4]。因此,开展栽培薄荷栽培过程中表皮毛形成研究,对了解人工薄荷品种退化及其产业发展具有重要意义。【前人研究进展】植物表皮毛发育受天气(如高低温和干旱等)、激素、分子调控和营养水平等影响[5]。薄荷表皮毛增加使得其商品性降低,如影响食用。目前,关于薄荷表皮毛研究主要集中于其形态结构和发育过程[6-8]等方面,研究表明薄荷表皮毛由原表皮细胞发育而来,主要由基细胞(略呈方形)、柄细胞(呈圆盘状)和顶细胞(也叫分泌细胞,呈近方形)3个部分组成,其中柄细胞决定薄荷表皮毛的类型和功能。转录组测序和基因组测序等组学方法,通过生物信息大数据分析获得目标候选基因,是目前获取目标候选基因的快速方法[9-13]。拟南芥中通过转录组测序获得响应盐、渗透和低温等胁迫候选基因[10],大籽雪胆通过转录组测序鉴定了合成葫芦素IIa候选基因[11];中华水芹通过转录组等组学方式揭示了木质素和纤维素合成基因[12];借助转录组测序揭示了芸苔素对胡萝卜叶柄延长的影响[13]。朱丹等[9]采用转录组测序技术研究薄荷幼苗响应干旱高温胁迫基因发现,干旱胁迫和干旱-高温胁迫薄荷幼苗分别产生4577和21 163个差异表达基因(DEGs),2种胁迫产生2141个共同DEGs,包括1219个共同上调DEGs和798个共同下调DEGs。【本研究切入点】植物表皮毛发育的分子机理调控是个非常复杂而精细的机制,且受环境因素的影响较大,如何快速获得调控薄荷表皮毛发育的关键基因,对控制和培育无毛薄荷品种具有积极作用。目前,有关转录组测序与基因组测序等基因组学方法应用于薄荷表皮毛发育方面的研究鲜见报道,调控薄荷表皮毛发育的转录因子也未见研究报告。【拟解决的关键问题】2019年,笔者在本地原始表皮毛较少(下称少毛)薄荷种质资源种群中发现1株茎及叶有较多的表皮毛(下称多毛)薄荷,2019—2022年以少毛薄荷和多毛薄荷为研究材料,采集二者茎段在大棚内营养充足环境下种植,采用转录组测序、组装和注释方法筛选影响薄荷表皮毛发育的候选基因,并对其进行克隆、生物信息及表达分析研究,以期为深入研究薄荷表皮毛发育、地方种质资源的保护与开发利用和新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 薄荷本地少毛薄荷品种及在2019年从该薄荷品种中获得的1株茎及叶中含有大量表皮毛的薄荷,由贵州省农业科学院园艺研究所提供。

1.1.2 试剂天根RNA试剂盒购自北京天根生物技术有限公司;反转录试剂盒(含有去除基因组DNA成分)、PCR聚合酶ExTaq和pMD19-T载体试剂盒购自宝生物工程 (大连)有限公司 (大连Takara公司);Axygen胶回收试剂盒购自Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd(上海)。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 2019年,采集少毛和多毛薄荷茎段,在大棚中进行种植,鉴定材料的稳定性。2022年6月,分别取少毛和多毛薄荷的嫩茎叶,用锡纸包好后,及时放入液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱中备用。一部分用于转录组测序,一部分用于提取RNA。

1.2.2 RNA提取与反转录采用天根RNA试剂盒,按照说明书提取RNA后,使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。cDNA用ddH2O稀释15倍后,保存于-20 ℃冰箱中,用于候选基因克隆和基因表达分析。

1.2.3 转录组测序分析将备用薄荷样品委托百迈客生物科技有限公司(北京)进行转录组测序。测序技术采用边合成边测序(Sequencing by synthesis,SBS)的方法,采用Illumina NovaSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序,确保数据有足够高的质量。使用Trinity软件(V2.5.1,主要参数:min contig length 200 group pairs distance 500 min kmer cov 1)将测序Reads打断为较短的片段(K-mer),并将小片段延伸成较长的片段(Contig),利用这些片段之间的重叠得到片段集合(Component),最后利用De Bruijn图的方法和测序Read信息,在各片段集合中分别识别转录本序列Unigene[14]。使用DIAMOND软件将Unigene序列与Nr、Swiss-Prot、COG、KOG、eggNOG和KEGG数据库比对[15],使用KOBAS得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果[16],InterProScan利用InterPro整合的数据库分析新基因的GO Orthology结果,预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对,获得Unigene注释信息[17]。

1.2.4 候选基因筛选少毛的薄荷材料仍含有少量表皮毛,表明少毛和多毛薄荷材料均具有形成完整表皮毛能力,可能是调控薄荷表皮毛发育的转录因子突变所致。为此,通过Nr、Swiss-Prot、COG、KOG、eggNOG和KEGG等数据库对Unigene基因注释的结果,筛选与表皮毛发育相关的转录因子[18]。将2种薄荷材料表皮毛发育相关的转录因子进行比对、ORF框(Open reading frame,可阅读框)查询和生物学信息分析,筛选出可能的候选基因。

1.2.5 候选基因克隆对获得的候选基因MhGL3(Transcription factor GLABRA 3)设计1对克隆引物MhGL3-KLF和MhGL3-KLR(表1)。采用PCR聚合酶ExTaq对候选转录因子MhGL3进行克隆,PCR体系50 μL,其中,2×ExTaq混合酶25 μL,cDNA模板2 μL,MhGL3-KLF和MhGL3-KLR引物各3 μL(引物浓度均为10 μmol/μL),灭菌的ddH2O补足50 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸120 s,34个循环;72 ℃延伸5 min后,8 ℃保存。扩增产物使用浓度(V/V)为1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,并将正确的目标条带进行回收。采用Axygen胶回收试剂盒按照说明书回收目的基因片段。按照pMD19-T载体试剂盒及其试剂盒说明书将回收的目的片段连接到载体上。利用42 ℃热激法将连接好的载体转化到大肠杆菌DH5α中,37 ℃、120 r/min摇床中摇菌 1 h后,12 000 r/min离心收集菌落涂布于含有氨苄青霉素(浓度100 mg/L)的LB培养基中,37 ℃倒置黑暗培养12～14 h。挑取单菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基培养6 h后,使用菌液PCR方法检测单菌落是否含有目的片段,并将正确的3个单菌落委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

表1 候选转录因子MhGL3的克隆、基因表达与内参引物

1.2.6 候选基因生物信息及表达分析使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线软件,对克隆得到的MhGL3转录子对应的氨基酸进行保守区域预测[19]。设计1对基因表达引物MhGL3-YGF和MhGL3-YGR(表1),分析多毛和少毛薄荷茎及叶的MhGL3表达分析,以薄荷Actin基因作为内参(引物为MhActin-YGF和MhActin-YGR,表1)。MhGL3表达分析程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,65 ℃延伸10 s,40个循环;72 ℃延伸2 min后,4 ℃保存。相对定量是基于处理和对照之间目标基因对参考基因表达量的比较[20],使用参照基因ΔCT法,表达差异为2-ΔCT。

ΔCT=CT目标基因-CT actin

1.3 数据统计与分析

使用Excel 2007和SPSS 20对数据进行统计和显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 少毛与多毛薄荷茎和叶的特征

植物在高低温、缺肥和干旱等条件下能够促进表皮毛发育。少毛薄荷茎段繁殖的植株仍表现为少毛(图1-A);多毛薄荷则表现为植株茎和叶表皮毛较多(图1-B)。表明,获得的表皮毛多的薄荷为稳定的材料,可用于后续研究。

图1 少毛薄荷(A)与多毛薄荷(B)的茎和叶Fig.1 Stem and leaves of M.haplocalyx with hairless hairs (A) and many hairs (B)

2.2 多毛与少毛薄荷RNA的转录组测序结果

多毛与少毛薄荷RNA的转录组测序结果显示二者分别获得12.40和12.12 Gb的转录组数据,Unigene基因39 853和30 249条,N50长度分别为1380和1434 bp,序列平均长度为789.44和779.03 bp(表2)。获得的转录组数据质量可用于后续薄荷表皮毛候选基因筛选研究。

表2 多毛与少毛薄荷RNA的转录组测序结果

2.3 候选基因筛选

植物表皮毛发育及调控的研究主要在转录因子上,包括正向调控和负向调控[5]。本研究中少毛和多毛薄荷均含有表皮毛,表皮毛数量的差异可能由调控因子导致。正向调控转录因子包括TTG1(TRANSPARENT TESTA GLABRA1)、bHLH-like transcription factors GL3 (GLABRA3,GL3)、EGL3(ENHANCER OF GLABRA3)、TT8(TRANSPARENT TESTA)和MYB等;负向调控转录因子包括CPC(CAPRICE)、TRY(TRIPTYCHON)、ETC1(ENHANCER OF TRY AND CPC1)和ETC2等[5]。

以多毛及少毛薄荷的转录组数据为基础分析可能影响植物刺毛发育的转录因子,结果显示,多毛及少毛薄荷中转录因子负向调控的转录因子在序列长度及结构上均无明显差异,而正向调控转录因子MhGL3的cDNA序列长度ORF存在明显差异,分别为1848和933 bp。

将多毛薄荷转录因子MhGL3的cDNA序列作为参考序列,以设计的MhGL3-KLF和MhGL3-KLR为克隆引物,分别以多毛及少毛薄荷的cDNA为模板,对多毛和少毛薄荷的转录因子MhGL3进行克隆,结果显示,多毛薄荷的MhGL3克隆长度为1848 bp,少毛薄荷的MhGL3克隆长度为1849 bp;克隆序列比对显示,多毛和少毛薄荷的转录因子MhGL3序列上存在12个位点差异。少毛薄荷MhGL3的ORF框长度仅为933 bp,在920 bp位置上多毛薄荷中缺失碱基A,其ORF框长度延伸到1848 bp(图2)。

HhBH-Hair,多毛薄荷;HhBH,少毛薄荷;红色箭头及红星分别为少毛薄荷缺失的碱基“A”和终止密码子。下同。HhBH-Hair, hairy M. haplocalyx; HhBH, hairless M. haplocalyx; The red arrow and red stars represent the missing base ‘A’ and termination codon of hairless M. haplocalyx.The same as below.

2.4 薄荷MhGL3生物信息分析

对比多毛和少毛薄荷MhGL3对应氨基酸序列与公布的唇形科植物西班牙鼠尾草(Salviahispanica)氨基酸序列(NCBI登录号:XP_047970505.1)的结果显示,多毛薄荷MhGL3对应的氨基酸序列长度为615 aa,与西班牙鼠尾草GL3氨基酸长度基本一致,而少毛薄荷MhGL3对应的氨基酸序列长度仅307 aa(图3)。使用SMART进一步对3个物种GL3氨基酸序列进行功能区域domain预测的结果表明,多毛薄荷及西班牙鼠尾草GL3氨基酸序列均含有2个保守区域,分别为bHLH-MYC_N和HLH,而少毛薄荷仅含有bHLH-MYC_N。3个材料的bHLH-MYC_N氨基酸位置均在15～198 aa,多毛薄荷和西班牙鼠尾草HLH保守区域分别在420～469和432～481 aa上,且多毛薄荷和西班牙鼠尾草HLH保守区域氨基酸长度均为50 aa(图4)。在拟南芥中,转录因子AtGL3具有HLH保守域[19],西班牙鼠尾草在其茎和叶柄上有一定数量的短表皮毛,暗示少毛薄荷转录因子MhGL3序列在920 bp位置中插入单核苷酸“A”,造成移码突变(Frame shift mutation),使其转录因子MhGL3出现过早终止(Premature termination),其ORF长度为933 bp,进而缺失了此转录因子的重要保守功能区域即HLH;多毛薄荷相对少毛薄荷在920 bp位置中无插入的核苷酸“A”,使其ORF长度延长,获得了该转录因子重要保守区域HLH,从而恢复了调控薄荷表皮毛发育的调控功能。

Salvia hispanica,西班牙鼠尾草 (XP_047970505.1)。下同。Salvia hispanica (XP_047970505.1). The same as below.

A.多毛薄荷;B.少毛薄荷;C.西班牙鼠尾草(XP_047970505.1)。A. Hairy M. haplocalyx; B. Hairless M. haplocalyx; C. S. hispanica (XP_047970505.1).

2.5 薄荷转录因子MhGL3的表达

在多毛和少毛薄荷茎及叶中转录因子MhGL3均有表达,茎中分别为7.42和6.21,叶中分别为4.84和4.62;多毛和少毛薄荷的转录因子MhGL3表达水平在茎和叶中均无显著差异(P>0.05),但MhGL3基因的表达量茎均高于叶(图5)。转录因子MhGL3在2种材料茎和叶中均有表达且存在差异,可能是少毛的原始材料中因缺少HLH结构域导致其不能显著调控植株表皮毛形成所致。

图5 多毛和少毛薄荷茎和叶中MhGL3的表达水平Fig.5 Expression levels of MhGL3 in stem and leaves of hairy and hairless M. haplocalyx

3 讨论

植物表皮毛对植物抵抗外界病虫害、高温和低温等具有显著作用[5,21-24]。一些植物表皮毛,如茶叶的“毫”[5,25]和西红柿的表皮毛[5,26]等能够分泌一些次级代谢产物;一些植物种子上的刺毛能够借助外力(如风)或者挂在人及动物身上传播[5],如蒲公英、鬼针草等;然而,一些植物表皮毛能够污染环境和影响人类健康,如杨树和悬铃木叶片及种子中的“絮”[27]。对于蔬菜作物而言,表皮毛不仅影响蔬菜的适口性,而且一些蔬菜种子的表皮毛使其很难进行播种,如胡萝卜[28-29]。对于薄荷,栽培上以少或者无表皮毛品种为主。贵州省野生环境中存在的野生薄荷资源种类多、资源丰富,大部分野生薄荷均含有一定的表皮毛。经过长期栽培及驯化,植株表皮无或少毛的薄荷品种已成为薄荷栽培的趋势。本研究中,从一个群体中获得表皮毛多的薄荷材料,该材料与表皮毛少的材料种植在同一个大棚中,其在抗白粉病和霜霉病、蚜虫等病虫害能力较表皮毛少的材料强,是否表皮毛多的薄荷材料在精油合成及含量上有优势,需要进一步研究。

研究结果表明,通过转录组测序方法和基因克隆,少毛薄荷是由于转录因子MhGL3在其序列 920 bp处的碱基“A”缺失导致其序列的延长,获得了转录因子GL3所需要的2个保守区域,从而使其具有调控表皮毛发育的功能,暗示HLH结构域是转录因子MhGL3调控薄荷表皮毛所必须。同时,多毛和少毛薄荷材料的转录因子MhGL3序列之间存在多处不同,暗示在自然栽培环境中薄荷表皮毛通过无性繁殖易发生突变[2,30]。另外,也暗示转录因子MhGL3可能为薄荷表皮毛发育的主要调控因子,该转录因子的突变能明显影响薄荷表皮毛的数量;培育无毛薄荷新品种,诱变MhGL3是关键。MhGL3能使薄荷表皮毛数量发生明显变化,但原始材料中仍存在部分表皮毛,可能还有其他转录因子对薄荷植株表皮毛进行微调控,需要进行下一步研究。