春尺蠖热激蛋白AcinHsp70基因的克隆、分子特性与表达分析

陈 龙,朱圣杰,崔阔澍,路 慧,王 靖,郝雅娴

(1. 河套学院农学系,内蒙古 巴彦淖尔 015000; 2. 四川省农业技术推广总站,成都 610041)

【研究意义】春尺蠖(Apocheimacinerarius)属于鳞翅目、尺蛾科昆虫,食性呈多样化。该虫主要分布于我国北方多个省(市、自治区),危害牧草、林木和经济树种[1-2]。近年来,危害对象逐渐由杨、桑、柳、柠条及经济类林木扩散到玉米和小麦等大田作物,危害区域也由北(内蒙古、新疆和河北等地)向南(四川、云南等)扩散。春尺蠖3龄幼虫于4月上旬出现并发生危害,此时内蒙古西部柠条天然草场的昼夜温差达10 ℃,能在如此恶劣环境中生存下来并发生危害,与其较强的抗寒性密不可分。热激蛋白(HSP)作为昆虫生存重要的调控因子,在昆虫生长、发育和繁殖以及在抵御外界不利环境的胁迫中具有重要作用[3-6]。因此,研究Hsp基因在春尺蠖对温度胁迫的响应机制具有重要意义。【前人研究进展】近年来,有关Hsp70基因的序列及在高温和低温胁迫下的表达均有报道。例如,韭菜迟眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)在40 ℃高温处理下,体内Hsp70与sHsp均上调表达[7]。绿豆象成虫高温处理后,CcHsp70-5基因表达量显著上调,推测该基因有助于绿豆象成虫抵御高温胁迫[8]。对梨小食心虫(Grapholithamolesta)[5]和空心莲子草叶甲(Agasicleshygrophila)[9]进行高温处理后,发现Hsp70基因表达量显著上调。对赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)不同龄期幼虫高温胁迫1 h中的研究发现,Hsp70基因的表达均不同程度上调1.1～2.0倍[10]。Li等[11]通过对松墨天牛(Monochamusalternatus)MaltHsp70-2的沉默研究中发现,在沉默MaltHsp70-2基因后,成虫的耐热性显著降低,该基因可能在成虫耐热性中扮演重要角色。在低温胁迫中,Hsp70基因同样起到保护昆虫机体的作用。如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)在-7 ℃低温条件下1 h,Hsp70基因表达量显著上调[12]。褐飞虱(Nilaparvatalugens)Hsp70的表达量在低温胁迫中下降,但不受高温影响[13]。此外,Hsp70不同亚族基因对高、低温胁迫也表现出不同的响应模式[14-15]。【本研究切入点】为深入探究热激蛋白70基因在春尺蠖应对低温胁迫中的作用,本研究基于前期组学数据,筛选Hsp70基因,结合Blastp和RT-PCR 技术克隆获取1个Hsp70基因,对其分子特征、理化性质和系统进化关系进行分析,同时分析该基因在不同温度和4 ℃不同时间胁迫下的表达谱。【拟解决的关键问题】明确Hsp70基因在春尺蠖3龄幼虫响应低温胁迫中的作用,为深入探究春尺蠖应对逆境胁迫的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

春尺蠖雌雄成虫在2021年春季采集于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗柠条草场(108°45′23.63″ E,40°46′4.19″ N),带回实验室后在室温下以柠条锦鸡儿成对饲喂养,将所产卵置于恒温(22±1) ℃、光周期L∶D=18∶6、相对湿度55%～59%的ZXQP-R1700 上海智城人工气候箱中孵化,孵化出的幼虫以柠条锦鸡儿连续饲养,待幼虫发育至3龄,选取供试幼虫(蜕皮后2 d)做以下处理:①在-10、-5、0、5和25 ℃不同温度下各处理1 h;②在4 ℃下处理0.5、1、3、5和7 h。每个处理3次重复,每次重复5头幼虫,处理结束后用液氮速冻,置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂

RNA提取、反转录、DNA纯化、pMD19-T连接载体和PCR Mix均购于大连宝生物有限公司;DH5α感受态细胞等购于天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 RNA提取及cDNA第1链的合成

选取1.1中处理的春尺蠖样品,置于高温灭菌后的研钵中添加液氮研磨,RNA提取步骤参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明书。分别利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度计检测RNA的质量和浓度,待检测指标合格后将RNA反转合成第1链。

1.4 春尺蠖AcinHsp70基因的克隆

根据前期河套地区绿色农产品安全生产与预警控制实验室已经获取的春尺蠖幼虫低温胁迫的转录组数据,以Hsp70为关键词在转录组数据库基因功能注释中搜索,结合NCBI BlastP验证,筛选出具有完整CDS序列的Hsp70基因,命名为AcinHsp70(GenBank登录号:OP750249)。根据转录组数据库中的基因序列信息,利用Primer Premier 5.0软件在AcinHsp70基因第74～2055 bp范围内设计RT-PCR扩增引物(表1)来完成基因完整CDS的扩增。

表1 春尺蠖AcinHsp70的克隆与qRT-PCR检测引物

PCR反应体系为25 μL,其中cDNA扩增模板1 μL,F/R引物各1 μL,PCR Mix 12.5 μL,最后无酶水补齐至25 μL。

PCR反应条件:首先进行5 min 94 ℃的预变性;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,运行30个循环;72 ℃运行10 min完成延伸过程,最后4 ℃低温保存。PCR扩增完成后,扩增产物用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测AcinHsp70基因的扩增状况,而后经PCR产物胶回收、亚克隆后提取质粒送测序上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.5 春尺蠖AcinHsp70基因的生物信息学分析

在NCBI 中利用(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线网站预测春尺蠖AcinHsp70基因的编码蛋白区。使用在线预测工具ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)预测春尺蠖AcinHsp70基因编码氨基酸的基本理化性质;使用DNAMAN 6.0软件分析春尺蠖及其他目昆虫的热激蛋白70基因氨基酸序列一致。利用SignalIP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线网站预测春尺蠖AcinHsp70基因蛋白N端信号肽;蛋白跨膜区域则利用TMHMM在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行预测;利用在线网站WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)进行亚细胞定位分析;磷酸化位点和糖基化位点预测分别选用在线预测网站NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和DictyOGlyc1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)在线预测。利用MEGA6.0软件构建系统进化树,参数为邻接法(Neighbor-joining, NJ)、P距离(P-distance),运行1000次。

1.6 春尺蠖AcinHsp70基因的表达

利用RT-qPCR检测春尺蠖Hsp70基因在不同温度及4 ℃不同时间处理下的表达谱,内参基因选用Actin,引物见表1,反应体系为20 μL:模板cDNA 2 μL,上/下游引物各0.4 μL,GoTaq®qPCR Master Mix 10 μL,以Free Water将体系补至20 μL,GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒说明书作为本实验的参照程序。

1.7 数据统计与分析

应用SPSS 20.0软件中的单因素方差分析中的Duncan多重比较分析对AcinHsp70基因差异表达情况统计分析,利用GraphPad Prism 7.0 软件作图。柱形图结果用平均值±标准误表示,差异显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 春尺蠖AcinHsp70基因的克隆

根据转录组数据库中已有的春尺蠖AcinHsp70序列信息,在基因编码蛋白区设计引物扩增目的基因CDS序列,以AcinHsp70的F/R为引物在目的基因外围扩增1988 bp的片段,经浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测在2000 bp处发现一条特异性单一条带(图1),经测序后发现上述条带分别包含转录组数据中1899 bp的Hsp70基因序列且序列信息比对一致。

M:DL2000 DNA Marker;1:春尺蠖 AcinHsp70 的PCR扩增产物。M: DL2000 DNA Marker; 1: PCR products of AcinHsp70.

2.2 AcinHsp70基因蛋白的生物信息学分析

春尺蠖AcinHsp70蛋白基因完整的CDS区为1899 bp,预测分子式为C3052H4904N876O971S16,共编码633个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为69.91 kDa和5.51,负电荷残基(Asp + Glu)总电荷为95,正电荷残基(Arg + Lys)总电荷为83,半衰期和脂肪指数分别为30 h和82.62。该蛋白的平均亲水性为-0.507,预测不稳定系数为33.19,故该蛋白属于亲水稳定蛋白,N端氨基酸为蛋氨酸(Met, M)。AcinHsp70基因蛋白具有Hsp70家族签名序列(图2),在N端均不含信号肽且无跨膜区。磷酸位点检测分别发现丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸位点24、26和8个(图3);未发现糖基化位点(图4)。此外,亚细胞定位结果发现其主要位于细胞质(图5)。

图3 春尺蠖AcinHsp70蛋白的磷酸化位点预测Fig.3 Prediction of the phosphorylation sites of the AcinHsp70 protein from A. cinerarius

图4 春尺蠖AcinHsp70基因的糖基化位点预测Fig.4 Prediction of the glycosylation sites of the AcinHsp70 gene from A. cinerarius

图5 春尺蠖AcinHsp70基因的亚细胞定位预测Fig.5 Prediction of the subcellular localization of the AcinHsp70 gene from A. cinerarius

2.3 春尺蠖AcinHsp70基因蛋白的序列一致性比对及系统进化关系分析

将春尺蠖AcinHsp70基因的氨基酸序列与NCBI中搜索得到的其它鳞翅目昆虫序列进行比对,春尺蠖与庆网蛱蝶的一致性最高(图6),达92.91%,其次为美洲棉铃虫(Helicoverpazea)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、柞蚕(Antheraeapernyi),一致性分别为91.80%、91.80%和91.17%,均在90%以上;而与斜纹夜蛾(Spodopteralitura)、家蚕(Bombyxmori)BmorHsp70A1和BmorHsp70的一致性均在90%以下,分别为89.11%、89.84%和83.88%。

Hsp70蛋白来源物种及其 GenBank 登录号。AcinHsp70: 春尺蠖 A. cinerarius Hsp70(MZ689788); McinHsp70-2:庆网蛱蝶 M. cinxia Hsp70-2(AGR84224.1); HzeaHsp70:美洲棉铃虫 H. zea Hsp70(ACV32640.1); AperHsp70-2: 柞蚕 A. pernyi Hsp70-2(ALL42052.1);HarmHsp70:棉铃虫H. armigera Hsp70(ADP37711.1);SlitHsp70:斜纹夜蛾S. litura Hsp70(ADV03160.1);BmorHsp70A1:家蚕B. mori Hsp70 A1(NP_001296526.1);BmorHsp70:家蚕(NP_001037396.1);Consensus: 共有序列。

通过NCBI搜索其它目昆虫已上传的Hsp70基因的氨基酸序列与春尺蠖AcinHsp70序列信息结合构建系统进化树。系统进化结果显示(图7),春尺蠖AcinHsp70与鳞翅目昆虫Hsp70聚为一类,且与同鳞翅目昆虫的庆网蛱蝶亲缘关系最近。

春尺蠖AcinHsp70蛋白用三角标记。AcinHsp70 protein of A. cinerarium is marked with filled triangle.

2.4 春尺蠖AcinHsp70基因在不同温度胁迫下的表达谱

从图8中可知,AcinHsp70基因在回温与不回温下的表达量均在-10 ℃达到最大值,不回温条件下,随着温度上升表达量下降,除-10 ℃外,其余温度条件下差异不显著(P>0.05);回温条件下,随着温度上升表达量也呈下降趋势,其余温度条件下差异显著(-5与0 ℃、5与25 ℃之间无显著差异)(P<0.05);在相同温度下,除-10 ℃外,其余温度下基因表达量回温后均呈上升趋势,除5和25 ℃外,表达量差异显著(P<0.05)。

图8 春尺蠖AcinHsp70基因在不同温度胁迫下的表达量Fig.8 Expression profile of AcinHsp70 gene under different temperature stress of A. cinerarius

2.5 春尺蠖AcinHsp70基因在4 ℃不同时间胁迫下的表达谱

从图9中可知,AcinHsp70基因在4 ℃处理1 h 后表达量达最大值,总体呈先上升后下降趋势,在上升和下降阶段(除3和5 h)表达量均差异显著(P<0.05)。

图9 春尺蠖AcinHsp70基因在4 ℃不同时间胁迫下的表达谱Fig.9 Expression profile of AcinHsp70 gene in A.cinerarius under 4 ℃ stress for different time

3 讨 论

本研究基于前期已获取的春尺蠖幼虫不同温度胁迫下的转录组数据,从中筛选获取Hsp70基因,结合NCBI BlstP和RT-PCR技术,克隆获取Hsp70基因完整的CDS区,命名为AcinHsp70,同时上传NCBI获取GenBank登录号OP750249。在对春尺蠖AcinHsp70基因1899 bp的CDS区域分析中发现,该基因蛋白氨基酸尾部序列为EEVD,还发现3个Hsp70基因家族特有的标签序列,所以表明Hsp70属于胞质型Hsp70基因家族。此外,Hsp70基因蛋白的亚细胞定位结果显示,该基因主要位于细胞质中,进一步证实了上述结论。

Hsp70基因家族中2个亚家族诱导型Hsp70和结构型Hsc70,主要区别在于结构型Hsc70存在多个GGXP序列结构,而诱导型Hsp70则没有。通过分析AcinHsp70基因编码的蛋白序列,未发现该特征序列,同时结合表达谱情况(受温度诱导表达),进一步确认AcinHsp70是诱导型Hsp70基因。

从春尺蠖Hsp70基因与其它昆虫的系统进化树中发现,Hsp70基因在不同种类昆虫中具有较高的保守性,春尺蠖Hsp70基因与同为鳞翅目的庆网蛱蝶序列一致性最高,且具有较高同源性,但半翅目同翅亚目昆虫Hsp70基因相似度较低,系统进化树表现为半翅目的褐飞虱和同翅目的白背飞虱(Sogatellafurcifera)聚为一类,没有和半翅目昆虫的中华淡翅盲蝽(Tytthuschinensis)聚为一类,与同种的Hsp70基因亲缘关系较远,张青等[16]、谭瑶等[17]研究也出现类似结果,原因可能是与其亲缘关系更近的昆虫Hsp70还未被鉴定出来。本研究的春尺蠖未发现此现象,春尺蠖与庆网蛱蝶Hsp70亲缘关系最近,序列一致性达92.91%。

HSP70是生物体对外界温度胁迫响应联系紧密的一类蛋白质,相关研究也证实其在昆虫抵抗高/低温胁迫中具有重要作用[18-19]。春尺蠖3龄幼虫最早于4月上旬开始发生危害,此时当地昼夜温差较大(最大可达10 ℃),能在如此环境中生存下来且发生危害,与其极强的抗寒性密切相关,3龄幼虫作为危害的临界期,在该时期防治可以有效控制种群数量。本研究对春尺蠖3龄幼虫进行不同温度(-10、-5、0、5和25 ℃)回温与不回温及4 ℃不同时间(0、0.5、1、3、5和7 h)处理,通过qPCR技术检测AcinHsp70的mRNA表达水平来探讨该基因对温度的响应。在低温条件下,灰飞虱体内的LsHsp70基因和LsHsc70基因均可被诱导表达[12],但是Kim等[20]却发现灰飞虱体内另外2种Hsp70基因却不受低温诱导。大螟(Sesamiainferens)在应对低温胁迫时Sihsc70的表达并不显著[21]。低温可以诱导黑腹果蝇Hsp70Aa,但却不能诱导Hsc70-1[22]。本研究中AcinHsp70基因不回温下的表达量在-10 ℃达到最大值,其余温度无显著差异,结果表明AcinHsp70基因可被低温诱导表达,但仅限-10 ℃,高于-10 ℃的低温不需要更多的Hsp70,在常温下体内表达的Hsp70可以应对高于-10 ℃的低温胁迫。昆虫体内的多种Hsp70基因表达呈现多样化,说明昆虫体内不同Hsp70发挥不同作用。

在研究对环境应激的反应时,必须注意涵盖暴露和恢复两种情况[23]。本研究中,春尺蠖AcinHsp70在1 h低温处理后基因表达量未发生显著变化(-10 ℃除外),但在25 ℃回温30 min后发生显著上调(5 ℃除外),5 ℃虽然未发生显著上调,却呈上升趋势。在黑腹果蝇的研究中发现,Hsp70Aa基因表达量均在低温处理期间未发生明显变化,在回温后则发生明显上调[23]。推测春尺蠖在-10 ℃处理回温30 min后,Hsp70基因表达量逐步降低,可能因为在回温30 min后体内不需要大量的Hsp70蛋白,需要更多的回温时间才能实现表达上调,例如在对大豆蚜若蚜高温胁迫回温2 h后,Hsp70基因的表达量显著影响上调[24]。

有研究表明,热激蛋白的表达有助于提高生物抵御逆境的能力,但是会消耗体内很多能量,对其它蛋白的合成造成影响,严重时会造成寿命缩短和生殖能力下滑,所以显著的诱导表达不能长久和稳定[25]。本研究将春尺蠖3龄幼虫在4 ℃条件下处理,随着处理时间延长,AcinHsp70基因的表达量先上升后下降,在1 h处达到最大值,达到对照的23.92倍,在上升和下降阶段(除0.5和7 h)差异显著(P<0.05)。韩岚岚等[24]和谭瑶等[17]分别对大豆蚜(Aphisglycines)热激和沙葱萤叶甲(Galerucadaurica)卵低温处理后也发现类似的结果,由此推测,随着低温胁迫时间的延长,过多的变性蛋白影响了AcinHsp70的表达。

4 结 论

获取了春尺蠖诱导型Hsp70基因,对其分子特征与低温胁迫下的表达情况进行分析,在春尺蠖体内存在结构型和诱导型Hsp70,今后笔者将对2种热激蛋白基因进一步研究,才能深入系统地了解Hsp70基因家族在响应外界不利环境中的作用机理。此外,本研究仅从基因水平对AcinHsp70研究,蛋白水平及缺失研究也十分重要。春尺蠖雌雄成虫最早于2月下旬羽化出土,所处温度远低于-10 ℃,Hsp70基因在成虫低温应激的机制更为突显,需进一步研究。