存活素和细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2B在骨髓增生异常综合征诊断及患者预后评估中的临床价值研究

马丽丽,付长江

(1.赤峰市医院血液科,内蒙古 赤峰 024000;2.赤峰学院附属医院介入科,内蒙古 赤峰 024000)

骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)是以血细胞性质、数量异常为主要特征恶性克隆性造血干细胞疾病,患者骨髓增生较活跃,外周血细胞减少,极易引发白血病,严重威胁患者生命健康[1-2]。该疾病高发于老年群体,发病隐匿,临床常出现漏诊和误诊现象,目前国内外研究重点一直放在诊断和治疗方面[3-4]。现阶段外周血及骨髓形态学检查、细胞遗传分析、流式细胞免疫表型分析等是临床常用的MDS诊断方式,具有一定应用价值,但仍缺乏识别恶性克隆的敏感度和特异性[5-6]。有研究[7-8]表明,MDS患者髓内无效造血主要原因可能是细胞过度凋亡,而造血细胞大量增殖会导致基因组不稳定,因此基因突变分析可能是MDS临床诊断的新方式。存活素(Survivin)可以调控细胞增殖与凋亡,而细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2B(Cyclin dependent kinase inhibitor 2B,P15INK4B)有抑制分裂细胞的作用,可以控制细胞增殖[9]。但Survivin、P15INK4B在MDS中的研究较少,故本研究对MDS患者Survivin和 P15INK4B表达展开分析,探讨其在MDS诊断及患者预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年5月至2022年5月本院收治的MDS患者150例,设为观察组,其中男性96例,女性54例;年龄49～68岁,平均(59.42±4.33)岁;体重指数(BMI)20～26 kg/m2,平均(23.01±1.08)kg/m2;高中及以下96例,大专及以上54例;低危45例,中危79例,高危26例;糖尿病32例,肺部疾病21例。病例纳入标准:符合MDS诊断标准[10],临床确诊为MDS;心、肺、肝、肾等重要器官功能正常;精神和认知功能正常,可以进行有效沟通;各项数据资料完整,不会对研究结果产生影响;签署知情同意书。排除标准:伴有先天性血液系统疾病;伴有恶性肿瘤、再生障碍性贫血及感染性疾病;免疫系统异常,可能影响研究结果;中途退出。另选取同期于本院进行体检的健康者150例为对照组,其中男性94例,女性56例;年龄48～70岁,平均(59.88±4.25)岁;BMI 20～26 kg/m2,平均(23.14±1.21)kg/m2;高中及以下93例,大专及以上57例;低危47例,中危80例,高危23例;糖尿病30例,肺部疾病20例。两组一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会审核通过(伦理批号:20190425)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞表面标记检测:抽取所有研究对象1～2 ml骨髓,EDTA抗凝,幼稚细胞群、成熟粒细胞群和成熟单核细胞群采用CD45/SSC双参数散点图识别,流式细胞仪检测不同细胞群的分化抗原表达。磷酸盐缓冲液对细胞浓度进行稀释,随后室温下进行单克隆抗体标记,将调整浓度后的100 μl单细胞悬液加入充分混合,再加入红细胞裂解液2 ml,1500 r/min离心5 min,去除上层血清,磷酸盐缓冲液洗涤1次,磷酸盐缓冲液固定后上机检测,统计阳性率(实际检测到的基因例数占总例数的百分比)。

1.2.2 Survivin和P15INK4B mRNA表达检测:细胞中总RNA采用TRIzol法提取,测定光密度值,随后以β-actin为内参(正向引物序列为5’-CGCTGCCACCGTAATCCGGACA-3’,反向引物序列为5’-GTCACGCAATTTCGACCCCGCT-3’),采用反转录PCR(RT-PCR)检测Survivin、P15INK4B mRNA表达。Survivin mRNA正向引物序列为5’-CTAUCTCAAGGTGCACCGCAGC-3’, 反向引物序列为5’-GAGGCCATGGCAGCCAGCTAC-3’,扩增条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性45 s,72 ℃退火1 min,循环40次。P15INK4B mRNA正向引物序列为5’-ACGTCGCGGCAGCGATGCT-3’, 反向引物序列为5’-CUGTGGGTGCAUGTGGGAACA-3’,扩增条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸40 s,循环30次。

1.2.3 预后随访 对观察组患者进行为期1年的随访。随访结束后,将病死者归入病死组,将其余患者归入存活组。

2 结 果

2.1 两组Survivin、P15INK4B阳性表达率及mRNA表达水平比较 见表1(图1、2)。观察组Survivin阳性表达率及mRNA表达水平高于对照组,P15INK4B阳性表达率及mRNA表达水平低于对照组(均P<0.05)。

表1 两组Survivin、P15INK4B阳性表达情况及mRNA表达水平比较

图1 两组Survivin阳性表达情况(×400)

图2 两组P15INK4B阳性表达情况(×400)

2.2 不同预后患者Survivin、P15INK4B mRNA表达水平比较 见表2。150例MDS患者中50例病死,1年生存率为66.67%(100/150)。病死组Survivin mRNA表达水平高于存活组,P15INK4B mRNA表达水平低于存活组(均P<0.05)。

表2 不同预后患者Survivin、P15INK4B mRNA表达水平比较

2.3 Survivin、P15INK4B对MDS的诊断价值 见表3。Survivin、P15INK4B对MDS均有较高诊断价值,两者联合检测的诊断价值更高(Z=3.328、4.072,均P<0.05)。

表3 Survivin、P15INK4B对MDS的诊断价值

2.4 Survivin、P15INK4B对MDS患者不良预后的评估价值 见表4。Survivin、P15INK4B对MDS患者不良预后均有较高诊断价值,两者联合检测的评估价值更高(Z=4.477、2.520,均P<0.05)。

表4 Survivin、P15INK4B对MDS患者不良预后的评估价值

3 讨 论

MDS是以骨髓细胞异常分化、成熟和骨髓衰竭为特征的异质性骨髓肿瘤,部分患者病情数十年也无明显变化,但部分患者从低危进展为高危后极易发展为白血病,更有部分患者因骨髓功能衰竭而病死[11-12]。有研究[13-14]表明,细胞凋亡属于一种细胞死亡程序,具有保守性、遗传性和渐进性等特点,该程序异常与MDS发病机制有关,具有独特的生化和形态学特性。细胞凋亡异常往往与癌症的发生具有紧密联系,影响血液恶性肿瘤的发生和发展,进一步增加该疾病诊断难度[15-16]。因此,为寻找MDS更具特异性的诊断方式,为该疾病治疗提供新靶点,本研究对 MDS患者凋亡抑制因子Survivin、P15INK4B阳性表达情况及mRNA表达水平进行分析,观察其应用价值。

Survivin是具有抗细胞凋亡功能的凋亡抑制基因,且与一些肿瘤预后具有相关性[17-18]。P15INK4B属于细胞周期负调控基因,有抑制细胞周期蛋白依赖激酶4、6的作用,进一步对细胞G1期至S期起到调控作用,故P15INK4B基因还属于候补的肿瘤抑制基因[19-20]。本研究结果显示,观察组Survivin mRNA表达水平较对照组更高,P15INK4B mRNA表达水平较对照组更低,与MINAIYAN等[21]及LOUNTOS等[22]研究结果一致,提示MDS患者Survivin高表达,P15INK4B低表达。其原因可能是:外周分化成熟的细胞较少,但骨髓增生活跃,使骨髓中粒系、红系和巨核系细胞凋亡增加,导致患者无效造血;Survivin只在转化细胞和增殖细胞中被检出,可以加速细胞有丝分裂,促使细胞快速分裂为相同的子细胞,其过度表达会导致癌细胞分裂旺盛,快速增殖,从而加速MDS发展[23-24]。同时,MDS发病机制之一为基因的高度甲基化,而基因高度甲基化会发生基因沉默,导致肿瘤细胞过度增殖,加速疾病发展[25]。P15INK4B作为候补肿瘤抑制基因,在多种恶性血液疾病中常表现为基因纯合子缺失,甲基化异常,而P15INK4B基因甲基化与血液特征和细胞遗传学具有相关性,超甲基化则会加快疾病进程[26]。本研究结果显示,病死组Survivin mRNA表达水平较存活组更高,P15INK4B mRNA表达水平较存活组更低。

此外,本研究通过绘制ROC曲线发现,Survivin、P15INK4B表达水平对MDS具有一定诊断价值,对MDS患者不良预后同样具有较高评估价值,两者联合检测不但对MDS有更高的诊断价值,而且对MDS患者不良预后也有更高的评估价值,提示Survivin、P15INK4B检测在MDS患者中具有较高的应用价值。

综上所述,MDS患者Survivin高表达,且与患者预后呈正相关;P15INK4B低表达,且与患者预后呈负相关;两者均可用于MDS的诊断及不良预后的评估,联合检测有更高的价值。但上述检测对实验操作的要求较高,可能不适用于所有医院,后续还需进行更加深入的研究,为MDS的临床诊断提供更加简便、准确、科学的方法。