胆囊癌中微小RNA的功能及临床价值研究进展

陈茜 朱鹏

胆囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是临床上十分常见的消化道恶性肿瘤,导致了十分严重的社会及医疗负担[1]。全球每年新发GBC患者约12万,超过70%的新发GBC患者在亚太地区,每年约8万患者因GBC病死,标准化病死率为0.84/10万人,是发病率及致死率都较高的消化道恶性肿瘤[1, 2]。由于胆囊的解剖学位置和功能特殊,GBC患者早期无显著的临床表现及体征,且缺少筛查特异性的生物学标志物,GBC在确诊时通常都处于疾病中晚期,丧失了手术根治性切除的机会,患者预后通常较差,短期病死率高[3]。流行病学资料显示,GBC的总体生存率(overall survival,OS)极低,未经根治性手术治疗的GBC患者3年总体OS低于30%[4]。类似其他实体恶性肿瘤,GBC致病及进展的相关机制十分复杂,目前尚未完善阐明[5, 6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在人体内广泛分布的不具有编码功能的小RNA,miRNA通常由19～24个核苷酸组成,其功能主要依靠直接结合到特定靶基因的3′-非编码区(untranslated region,UTR)来影响该基因翻译为功能蛋白,从而对机体各类病理生理过程发挥调控作用[7]。既往研究显示,miRNA在GBC的发生与发展中发挥着十分重要的调控作用[8]。基于此,本文对GBC中miRNA的调控功能及临床应用方面的研究进展进行了简要综述,以期为临床诊疗提供参考。

一、特异性miRNA参与调节GBC发生及发展

GBC作为恶性度极高的消化系统肿瘤,其致病机制十分复杂,多个分子信号通路在其中相互影响,导致了GBC的发生[9]。特异性miRNA表达水平的改变也在GBC的发生中发挥重要调控作用,相关的研究方面也积累了大量证据。Su等[10]研究显示,通过生物信息学数据库筛选出GBC中存在159个在GBC中表达存在异常的特异性miRNA,包含34个上调miRNA及125个下调的miRNA。数据分析显示,表达增强的miRNA-125a-3p、miRNA-4647,以及表达降低的miRNA-29c-5p、miRNA-145a-5p、miRNA-192-5p、miRNA-194-5p、miRNA-339-8-3p的改变差异最为明显,且与GBC患者的生存预后存在相关性。基于信息学分析,同时还发现STEAP3-AS1/hsa-miR-192-5p/MAD2L1信号传导通路在调控GBC肿瘤细胞的细胞周期及增殖中具有重要调控作用。Cao等[11]基于生物信息学数据库的分析显示,来源于GBC患者的肿瘤组织中存在25个表达升高的miRNA及97个表达下降的miRNA,其中 miRNA-4430及miRNA-642a-3p升高最为明显,miRNA-451a及miRNA-145-5p降低最为明显,基于GO及KEGG分析显示,上述miRNA的调节基因主要为mTOR及PI3K-Akt信号通路的相关功能蛋白,上述信号通路主要在细胞周期及凋亡作用中发挥重要调控作用。Tong等[12]纳入了39名GBC患者,结果显示,GBC患者原位肿瘤组织中的miRNA-197表达显著升高,且其升高程度与患者不良预后存在相关性。在细胞模型中降低miRNA-197的表达可抑制GBC细胞增殖并促进细胞凋亡。双荧光素酶实验显示,miRNA-197可以直接结合到IGFBP3的3-UTR,从而抑制其表达,并降低增殖相关蛋白p-ERK1/2、pAKT的表达,并增加凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、caspase-3的表达,从而实现上述调控功能。Ouyang等[13]研究也发现,与匹配的癌旁组织相比,GBC肿瘤组织中的miRNA-146b-5p表达显著降低,而对应的靶向调控基因Toll样受体4(TLR4)的表达则显著升高。进一步研究表明,miRNA-146b-5p表达减少可导致TLR4表达增高,从而激活NF-κB信号通路,增强肿瘤细胞的增殖能力。同时,研究者还在BALB/c裸鼠异种移植瘤模型中进行了验证,通过分子技术增强miRNA-146b-5p的表达则可达到缩小肿瘤体积、抑制肿瘤细胞生长的作用,这也提示了miRNA-146b-5p/TLR4/NF-κB信号通路在调节GBC致病中具有重要的功能作用。Wang等[14]对GBC肿瘤组织中miRNA的表达情况进行了分析,结果显示,与健康对照相比,长期存活GBC及短期存活GBC患者分别存在104级124个特异性miRNA的表达异常。长期存活GBC患者的miRNA-1421a-5p、miRNA-146b-5p,以及短期存活患者的miRNA-30a-3p、miRNA-660-5p、miRNA-338-3p的表达差异最为明显。富集分析显示,在短期存活GBC患者中miRNA失调涉及46个生物学过程及44个信号通路功能的紊乱等。上述研究结果均提示了特异性miRNA在调控GBC肿瘤细胞增殖中的重要作用,但是由于目前研究技术和生物信息学分析工具的限制,对于特异性miRNA在GBC致病中作用的分析往往只能从单一的信号通路入手,而一些特异性miRNA及其下游的功能蛋白可能在多个信号通路中发挥作用,因此未来还需要更为优良的分析方法来进一步阐述miRNA参与GBC的致病机制。

另一方面,侵袭及转移是恶性肿瘤最重要的特点,也是导致患者临床预后不佳的重要原因之一。GBC恶性程度较高,其侵袭及远处转移在临床上也十分常见。特异性miRNA作为调控GBC肿瘤细胞功能的重要因子,大量研究证据也显示其参与了对GBC侵袭及远处转移的调控。Zhang等[15]最新研究发现,在来源GBC患者的肿瘤组织及模型细胞系(GBC-sd、SGC-996)中均可观察到miRNA-182的表达升高。在模型细胞中降低miRNA-182的表达则可以显著减弱GBC细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用,降低波形蛋白表达,增高E-cadherin表达,从而减弱肿瘤细胞侵袭及迁移的能力。机制分析显示,FOXN3是miRNA-182的靶向调控基因,miRNA-182可以直接结合到FOXN3的3-UTR,从而抑制FOXN3表达,并激活Wnt/β-catenin信号通路,促进EMT的发生。Hu等[16]研究发现,来源于GBC患者的肿瘤组织中存在miRNA-4733-5p表达显著升高,而KLF7(krppel-like facotr-7)表达则显著降低。机制分析显示,KLF7是miRNA-4733-5p的靶向调控基因。同时研究者还在移植瘤动物模型上进行了验证,结果显示miRNA-4733-5p可以促进GBC肿瘤细胞的增殖并增强其侵袭能力,其也主要通过抑制KLF7的表达来实现上述功能调控作用。Jiang等[17]研究也发现,与匹配的癌旁组织相比,GBC肿瘤组织中miRNA-365的表达显著降低,增强miRNA-365的表达则可显著抑制GBC模型细胞的增殖及转移能力。荧光素酶分析显示Ras相关C3肉毒毒素底物1 (RAC1)是miRNA-365的直接调控靶点。特异性miRNA-365表达降低的同时RAC1表达增强,并促进GBC的侵袭能力显著升高。

二、特异性 miRNA用于GBC诊断及预后的临床价值

GBC起病隐匿,早期通常无显著临床症状和体征,大量患者在临床确诊时已处于疾病中晚期,失去了根治性手术的机会,导致GBC的总体预后不佳[18]。临床上对GBC的早期诊断及准确评估有助于及时指导临床干预措施,从而最大限度地改善GBC患者的预后。目前针对GBC的早期诊断方法包括血清学指标及影像学检查,均存在诊断特异度较低的不足,临床上也一直在寻找改进GBC早期诊断的方法[19]。Yang等[20]基于多中心患者的研究发现,GBC患者存在血清miRNA-552-3p、miRNA-581、miRNA-4433a-3p、miRNA-496和miRNA-203b-3p表达的升高。同时,研究者建立了联合上述5项miRNA的早期诊断模型,并在患者队列中进行了验证(包含102名GBC患者及112名慢性胆囊炎患者多作为对照),结果显示,联合模型诊断GBC的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.905,灵敏度和特异度分别为81.37%和86.61%,且诊断准确度甚至优于血清糖类抗原-199(carbohydrate antigen-199,CA-199)及癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)。庄琰等[21]基于中国GBC患者的研究也显示,使用血清miRNA-29c-3p水平作为无创指标诊断GBC的AUC可达71.7%,诊断灵敏度和特异度分别为82.4%和64.5%。此外,使用血清miRNA-29c-3p联合多层螺旋CT及血清lnc RNA TUG1用于诊断GBC的AUC可达85.5%,诊断灵敏度及特异度分别为78.4%及90.8%,提示miRNA-29c-3p联合影像学等指标用于GBC的早期临床诊断具有较高的价值。上述研究结果提示血清特异性miRNA作为无创生物学指标诊断GBC具有一定的临床价值,但是目前的研究证据仍不够充分,还需要更多深入的前瞻性研究对miRNA的临床诊断价值进行验证,包括尝试建立包含miRNA的联合诊断模型等来改进对GBC的诊断。

特异性miRNA不仅在用于GBC的诊断上具有潜在的临床价值,对于GBC的预后评估也体现了一定价值,在这方面也积累了大量的研究证据。Chen等[22]研究发现,GBC肿瘤组织中的miRNA-139-5p表达显著降低,且低miRNA-139-5p表达与不良预后存在显著的相关性。同时机制研究也显示,丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)是miRNA-139-5p调控的直接作用靶点,miRNA-139-5p能够抑制PKM2表达,从而影响GBC细胞的能量代谢能力。在动物实验中也发现,增强miRNA-139-5p表达可显著抑制GBC细胞的增殖、迁移及侵袭。Lv等[23]开展的临床研究纳入了159名GBC患者,收集了患者的肿瘤组织及匹配的癌旁组织,并检测了组织中的miRNA-146-5p表达程度。结果显示,GBC肿瘤组织中的miRNA-146-5p表达程度显著降低,且miRNA-146-5p表达与TNM分期(P=0.009)、肝脏转移(P=0.001)及肿瘤低分化(P=0.001)存在相关性。Kaplan-Meier生存分析显示,高表达miRNA-146-5p的GBC患者总体生存期高于miRNA-146b-5p低表达患者(P=0.0005),且低miRNA-146b-5p表达是GBC患者不良预后的独立预测因子。Zhang等[24]研究发现,GBC肿瘤组织中的miRNA-204表达较健康对照组显著降低,且低miRNA-204表达程度与高临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、远处转移及低分化存在正相关。机制分析显示,miRNA-204主要通过直接靶向抑制Notch2的表达,从而参与对GBC肿瘤细胞的细胞周期及凋亡功能的调控。同时基于患者随访(3年)的结果发现,低miRNA-204是患者临床预后的独立危险因素(OR=2.35,P<0.01)。徐顺林等[25]研究也发现,GBC患者存在血清miRNA-187表达升高及miRNA-143表达的显著降低,miRNA-187及miRNA-143表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期存在相关性。单因素分析显示,高miRNA-187表达或低miRNA-143表达的GBC患者3年OS更低。多因素Logistic回归分析显示,TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)(OR=3.529,P=0.029)、淋巴结转移(OR=4.208,P=0.001),高miRNA-187表达(OR=3.626,P=0.013)、低miRNA-143表达(OR=3.758,P=0.004)是影响GBC患者3年OS的独立影响因素。上述研究结果均显示了使用特异性miRNA来作为GBC患者的临床预后指标具有重要的临床价值。

三、靶向miRNA的治疗GBC的临床价值

由于GBC患者在确诊时通常分期较晚,丧失了根治性手术治疗的机会,临床预后通常较差。目前对于早期GBC的治疗主要推荐外科根治性手术,而对于中晚期GBC患者,包括放化疗在内的治疗方法均不能获得满意的疗效,中晚期GBC患者通常在较短时间病死[26]。临床上也一直在探索针对GBC患者的更为安全有效的特异性药物。基于特异性miRNA在GBC的发生与致病中的重要作用,也有大量研究尝试靶向特异miRNA的方式来治疗GBC,也取得了一些重要的研究进展。然而,这些方法目前仍只是停留在细胞及动物模型层面,距离临床实际应用尚有问题需要克服。

其一,研究数据也显示,直接通过调控特异性miRNA的表达水平来发挥对肿瘤的抑制作用存在可能。Zhu等[27]研究发现,GBC患者的肿瘤组织及模型动物中均存在miRNA-195-5p表达的显著降低。荧光素酶分析显示,miRNA-195-5p能够靶向抑制GBC细胞中的FOSL1表达,而FOSL1是参与肿瘤细胞周期调控的重要功能蛋白,其能够通过激活下游的Wnt/β-catenin信号通路来实现对肿瘤细胞增殖的调控。研究者还发现,通过基因转染来增强miRNA-195-5p的表达能够显著抑制GBC细胞的增殖及侵袭能力,从而发挥对肿瘤的抑制作用,这也提示miRNA-195-5p可能作为治疗GBC的重要靶点。Yan等[28]研究也发现,与健康对照相比,GBC肿瘤干细胞中miRNA-4461表达显著降低,增强细胞模型中的miRNA-4461的表达可限制抑制GBC细胞的增殖,同时降低肿瘤细胞的侵袭能力。功能分析显示,miRNA-4461主要靶向抑制EGFR的表达,从而影响下游的AKT活性,来发挥对肿瘤细胞的抑制作用。Li等[29]研究发现,GBC肿瘤组织中的miRNA-188-5p表达显著降低,且miRNA-188-5p下降程度与更大的肿瘤体积、更多的淋巴结及广泛远处转移相关。同时miRNA-188-5p高表达患者的OS比miRNA-188-5p低表达患者更长。增强miRNA-188-5p的表达可抑制GBC肿瘤细胞的增殖能力,并减弱肿瘤侵袭能力。机制分析显示,miRNA-188-5p能够调控GBC中的Wnt/β-catenin信号通路及p-38/JNK信号通路功能,从而实现上述作用。

其二,特异性miRNA也可能作为辅助治疗方法来改善常规化疗的疗效。Wang等[30]研究发现,GBC细胞模型(GGC-SD和SGC-996细胞株)中存在miRNA-335表达的显著降低,且miRNA-335降低程度与肿瘤体积及临床分期密切相关。通过转染miRNA-335微粒来增强GBC模型细胞对5-氟氟嘧啶的敏感度,并抑制肿瘤细胞的增殖。机制分析也显示miRNA-335主要通过抑制MEF2D基因的表达,从而影响肿瘤细胞周期中G1/G0期。Gong等[31]研究发现,与匹配的癌旁组织相比,GBC患者原位肿瘤组织中的miRNA-1231表达显著降低,且miRNA-1231表达越低、肿瘤体积越大、分期越晚,总体预后更差。荧光素酶分析显示FOXC2是miRNA-1231的靶向调控基因。基于细胞模型的研究显示,通过增强miRNA-1231表达,可抑制FOXC2的转录,从而减弱GBC的增殖,并增强肿瘤细胞的凋亡作用。此外,研究还发现,升高miRNA-1231的表达还可增强GBC肿瘤细胞对化疗药物多西他赛的敏感度,增强药物疗效。Yang等[32]研究发现,GBC模型细胞中miRNA-193a-3p表达显著降低,通过增强miRNA-193a-3p表达可减弱GBC肿瘤细胞的增殖能力,诱导肿瘤细胞凋亡。研究者在移植瘤小鼠模型中还发现,增加miRNA-193a-3p表达可以增强GBC肿瘤对曲美替尼治疗敏感度,增强药物疗效。机制分析显示,miRNA-193a-3p主要通过靶向调控基因KRAS的表达来实现上述功能。上述研究结果也初步显示,特异性miRNA在用于改善GBC患者对化疗药物敏感性方面具有潜在的临床价值。

四、问题及展望

综上所述,特异性miRNA在GBC的致病及进展中发挥着十分重要的调控功能。同时作为检测较为便捷的无创生物学指标,特异性miRNA在用于GBC的早期诊断及预后评估方面也积累了一定的证据,显示出了较高的价值。靶向特异性miRNA用于GBC治疗的研究目前仍停留在细胞及动物模型阶段,距离临床实际应用仍有巨大的差距。下一步仍需深入探讨miRNA参与调控GBC发生及发展的具体生物学机制,从而为筛选临床诊断评估指标及探索更为安全有效的分子靶向治疗方法提供参考,使更多的GBC患者从中获益。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。