鱼油n-3 PUFA 富集、稳态化技术及生物活性研究进展

2024-03-12刘书源郭明珠马爱进桑亚新孙纪录

中国食品学报 2024年2期

刘书源，郭明珠，马爱进，桑亚新，孙纪录*

（1 河北农业大学食品科技学院河北保定071000 2 北京工商大学食品与健康学院北京 100048）

鱼油由鱼类及其加工副产物中提炼所得[1]，二十碳五烯酸（Eicosapentaenoicacid，EPA）、二十二碳六烯酸（Docosahexaenoicacid，DHA）等n-3 多不饱和脂肪酸（n-3 Polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFA）含量丰富[2]，同时富含维生素A、D、E、K 等多种营养元素[3-5]，营养价值较高。鱼油中的n-3 PUFA 是生物活性物质的良好来源[6]。国内外针对鱼油的开发与研究热度持续不减，其抗炎抗癌，提高记忆力，改善视力等多种医学功效的证实使鱼油无论是在食用油、婴幼儿乳粉配方等食品方面，还是在软胶囊、咀嚼乳等功能性食品方面被广泛应用。根据《2021 中国渔业统计年鉴》中针对2020 年和2019 年全国水产加工情况的统计分析[7]，在全国水产加工品总量幅度下滑的同时，鱼油制品的总量依旧处于增长趋势，涨幅达到8.68%，居于首位，发展空间巨大。基于此，对鱼油n-3 PUFA 富集、稳态化技术及生物活性的研究在水产品加工领域具有重要意义。

1 鱼油n-3 PUFA 富集方法

EPA 和DHA 的相对含量是判断鱼油营养价值的重要标准[8-9]，表2 列举了14 种常见鱼类油脂中的EPA 和DHA 总相对含量，金枪鱼最高，为31.65%；草鱼最低，为1.82%，均不能满足食品领域与医疗行业的需求。

表1 2020 年全国水产加工品总量[7]Table 1 Total amount of aquatic products processed in China in 2020[7]

表2 14 种鱼类油脂中EPA 和DHA 总相对含量Table 2 Total relative contents of EPA and DHA in 14 species of fish oils

表3 鱼油n-3 PUFA 富集方法比较Table 3 Comparison of enrichment methods of fish oil n-3 PUFA

表4 鱼油n-3 PUFA 稳态化技术比较Table 4 Comparison of steady state technology of fish oil n-3 PUFA

为满足功能性食品和食品补充剂的制作需求，提取后的鱼油需经浓缩、富集来提高n-3 PUFA 的含量[21]，可通过冷冻结晶[22]、尿素包合[23]、分子蒸馏[24]、银离子络合[25]、超临界萃取[26]和脂肪酶[27]等方法来实现高纯度n-3 PUFA 的生产。

1.1 冷冻结晶法

冷冻结晶法依据低温环境下不同组分在有机溶剂中溶解度的差异进行分离[28]。该法操作方便、成本低廉[29]，且低温可减缓脂肪酸的氧化变质，其中溶剂分步结晶法较为常用[30]。郑飞洋等[31]通过对金枪鱼油中EPA 和DHA 富集效果的研究，在溶剂为乙腈与丙酮且体积比1∶12、鱼油与复合溶剂体积比7∶40、-50 ℃下结晶150 min，PUFA 含量达51.61%，EPA 与DHA 含量可达（12.83±0.34）%与（28.70±0.48）%。Zhang 等[32]对比了丙酮、己烷等6种溶剂的富集效果，在最优结晶条件下，EPA 与DHA 纯度可达15.1%，58.4%，相应产率分别为61.5%，61.8%。然而，该工艺过程极易造成溶剂残留，且对相关设备的要求较高，限制了该法的应用范围。

1.2 尿素包合法

尿素包合法通过低温分离不同种类的脂肪酸[33-34]，结晶时间、结晶温度、醇脲比和脲酯比为影响包合效果的主要因素[35]。该法成本廉价、反应迅速，包合过程中可生成稳定晶体，适宜工业化生产。Sathess 等[36]利用尿素络合对水产副产物中提取的n-3 PUFA 进行富集，所得产物品质及理化性质良好。Zheng 等[37]使用尿素包合法，通过响应面法优化海豹油中n-3 PUFA 最佳富集条件（脲酯质量比2.38∶1.00、15 ℃下结晶2.5 h），在最优条件下，n-3 PUFA 含量和回收率分别为71.35%和82.31%。

1.3 分子蒸馏法

即短程蒸馏，该法利用油脂在同一压强与温度下不同组分间挥发性的差异进行分离、纯化。此法作用时间短（1～60 s）[38]，不应用有机溶剂，避免产品的污染，可减少废物的产生，产品安全性较高。宋恭帅等[39]以大目金枪鱼油为原料进行精馏，获得EPA 乙酯含量达到82.40%，得率为39.00%。He 等[40]利用酶解结合分子蒸馏从富含DHA 的海藻油中分离饱和脂肪酸，150 ℃下通过分子蒸馏得到DHA 含量为70.27%。食品加工领域中，分子蒸馏虽多用于浓缩和纯化高黏度、高沸点、高分子质量且热稳定性差的有机化合物[41-42]，但该法对分子质量相近组分的分离效果不佳。

1.4 银离子络合法

银离子络合法利用Ag+与PUFA 中C=C 络合形成亲水极性化合物从而达到分析目的[43]。郑振霄[44]结合了尿素包合、分子蒸馏与银离子络合3种方法，在海豹油与AgNO3溶液质量比1∶2.75、8.5 ℃下反应5 h 后，产物中DPA 质量分数可达37.42%，提升显著。kirubanandan 等[45]发现AgNO3水溶液在微流体反应器中10 ℃下反应36 s 与在连续搅拌反应器中反应15 min 的效果差异很小，EPA 与DHA 含量可达38%～42%，27%～30%。银离子络合法反应条件虽温和、可获得高纯度产物，但产量较小，且AgNO3价格昂贵且Ag+回收率低，因此在大规模生产中不宜采用。

1.5 超临界萃取法

不同饱和度脂肪酸的溶解度在超临界流体中存在差异。Gan 等[46]以林蛙卵为原料，根据BBD（Box-Behnken Design）响应面模型得到最佳超临界CO2萃取条件为压力29 MPa、流量82 L/h、温度50 ℃、时间132 min，得到的实际最优产率为（13.29±0.37）%。Sara 等[47]将超临界萃取与共溶剂相结合从虾副产品中提取脂质和虾青素，结果表明提取物中的脂质与虾青素产率有显著提高。该法因具有萃取温度低、速度快、步骤较为简便、萃取组分不易降解等优点成为分离热敏性物质的最优法[48-49]。然而，该工艺产品得率较低，且对相近碳链长度的脂肪酸分离效果较差。

1.6 脂肪酶法

该法包括酯化法、酯交换法和水解法。Yang等[50]选用茶柱假丝酵母脂肪酶AY “Amano”400SD 富集金枪鱼油，得到的n-3 PUFA 含量可达57.7%。Akanbi 等[51]选用南极假丝酵母脂肪酶A富集藻油脂肪酸，DHA 含量从40%提高至82%。相较于传统的富集方法，脂肪酶法反应条件温和、适用性强、选择性高，可对EPA 与DHA 相对产量进行人为调控[52]。然而，脂肪酶法也面临酶种类少、价格高、失活等工艺难点。

尿素包合法和分子蒸馏法虽然是目前工业生产中使用较为普遍的富集方法，但尿素包合工艺中产生的废液废料并未得到妥善的处理；分子蒸馏工艺中的高温环境会造成有效成分的损失，影响产品产率与品质；冷冻结晶所得产品质量较差；AgNO3增加了银离子络合法的工艺成本；超临界萃取技术与脂肪酶法反应条件温和，可避免EPA和DHA 的氧化，同时无有机试剂残留，虽然二者均存在如何降低成本的工艺问题，但仍具较大的发展潜力。

EPA 和DHA 等生物活性物质易受环境因素而氧化变质，如何在富集过程中避免高温、高压对其造成的损耗是工艺优化的重点，同时仍要避免操作所造成的环境污染，并降低工艺成本。当前，复合技术被不断探索以富集鱼油n-3 PUFA，依据原料品质、产品特性选择不同联合富集方法，有利于在保证产品价值的同时实现生产效率的提升与成本的削减。

2 鱼油n-3 PUFA 稳态化技术

EPA、DHA 并不稳定，易受环境因子（光、热、氧、自由基等）影响而发生氧化、变异、降解等反应导致其生物活性降低甚至丧失，故通常采用稳态化技术，在不影响鱼油应有感官品质的基础上使其具有较强的环境应力耐受性，并保持或提高功能因子的生物活性。功能性油脂稳态化技术的作用机理分为3 点[53]：改变物料的物理形态（不造成物料化学性质特异性变化）；控制环境条件（温度、pH 值、离子强度等）并利用界面反应（吸附、凝聚、聚集等）形成空间网状结构（囊壳、凝胶、膜等）；对有效成分进行包埋以阻断不利因素对其的破坏。

2.1 微囊化技术

微胶囊能在一定条件下对所包裹的材料进行可控释放，是油脂稳态化技术的常用手段，自1883 年问世以来已得到充分的发展与认可。该技术可为物理法、化学法和物理化学法3 大类，共20 余种。食品加工领域中主要选用喷雾干燥法、凝聚法、包络结合法、锐孔-凝固浴法和冷冻干燥法微胶囊化鱼油。

2.1.1 喷雾干燥法该法利用喷雾装置在高温下雾化含有芯材并加入乳化剂而形成的壁材乳液，乳液小液滴在壁材凝固后即可得到微胶囊。此过程可得到较低水分活度的粉末状微粒[54]，产品质量较好。然而，该方法存在干燥颗粒不均、挥发性物质损失等不足，对壁材的选用标准也较高等缺点。Abdul 等[55]在进气温度140 ℃、壁材10%、泵速4 mL/min、针速5 s 条件下包埋率可达到（83.77±0.96）%。李杨等[56]使用大豆、乳清和豌豆3 种分离蛋白分别与麦芽糊精形成复合壁材，以卵磷脂为乳化剂制备鱼油微胶囊，结果表明乳清分离蛋白制备的乳液粒径最小、微胶囊的包埋率最高（95.34%）、氧化稳定性最好，且3 种鱼油微胶囊在200 ℃以下均有良好的热稳定性。

2.1.2 凝聚法该法以水溶性壁材包埋脂溶性材料，分为单凝聚法和复凝聚法，二者选用的壁材不同。单凝聚法壁材单一；复凝聚法壁材选用两种带相反电荷的物质，在改变体系温度、pH 值和水溶液浓度后，通过凝聚析出、分离、固化最终形成微胶囊[57]。该方法物料载量高、延缓脂溶性芯材氧化的同时可控制其释放，然而该工艺成本较高、能耗大、壁材要求高，且固定剂多为醛类，具有一定毒性，应用于食品的局限性较大。Xia 等[58]使用明胶-六偏磷酸钠复合凝聚物作为壳材料，通过复合凝聚法对金枪鱼油中酰甘油浓缩物进行封装，结果表明微胶囊化对其氧化稳定性具有显著提升。王正云等[59]以青鱼肝脏油脂为芯材，大豆分离蛋白（SPI）和壳聚糖（CS）为壁材，在pH 7.0、壁材总质量分数2%、SPI 与CS 质量比1.3∶1、芯壁质量比1.3∶1 条件下得到的鱼油包埋率可达（71.98±0.16）%，呈现出较好的包埋特性，氧化稳定性显著提高。

2.1.3 包络结合法包络结合法又称分子包埋法，是一种基于分子水平上的方法，一般选用β-环糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）作为包埋剂[60]，β-CD 内部中空部位的疏水性基团可与芯材结合形成包接络合物，从而完成包埋。该方法虽操作相对简单，且成本较低，但反应条件较难控制。苏阳等[61]在芯壁质量比1∶7、乳化剂使用量0.3 g/g、45℃下搅拌2 h 得到的鱼油微胶囊包埋率为90.75%，包埋效率为89.34%。张维等[62]利用超声波辅助分子包埋法，以β-CD 为壁材制备榛子油微胶囊，当壁材浓度比（H2O/β-CD）为16∶1、壁芯材质量比为5∶1 时在59.3 ℃下包埋62 min，微胶囊包埋率为69.18%，产率为59.74%，且具有良好的热稳定性。

2.1.4 锐孔-凝固浴法锐孔-凝固浴法主要应用于非水溶性固体粉末与疏水性液体的微囊化。该法结合了化学与物理机械学，通过可溶性聚合物壁材溶液包裹芯材使其呈球状液滴滴入凝固浴中形成微胶囊[63]。该方法虽成本低，操作简单，但所得产品直径较大[64]。黄美娥等[65]以鳡鱼肝脏油脂为原料，采用锐孔-凝固浴法在鱼油添加量5.0 g、海藻酸钠质量浓度1.5 g/100 mL、乳化剂添加量0.5 g、固化剂液质量浓度1.5 g/100 mL 条件下得到的微胶囊包埋率最高为97.27%。

2.1.5 冷冻干燥法冷冻干燥是利用升华作用将乳状液在冻结中去除水分形成微胶囊的过程[66]。该工艺虽对芯材损害小，但对设备要求高，操作相对复杂。Luciana 等[67]利用大豆蛋白将鱼油包裹在微胶囊中，通过乳化和冷冻干燥制备了不同质量比蛋白/油微粒，发现与喷雾干燥的微粒相比，冷冻干燥的微粒虽具有更好的固体回收率，但封装效率较低。车馨子等[68]在真空压力35 Pa、冷风风量5.5 m3/min 时得到粒径集中分布于117.13～200.06 μm 的微胶囊，质量较优，且EPA 和DHA相对含量分别增加了0.037%和0.966%。

2.1.6 纳米微囊化技术纳米微囊化是一种通过纳米乳化、纳米复合和纳米构造等技术使微型胶囊的大小在纳米范围内（1～1 000 nm）的新式技术[69]，主要包括乳液聚合法、界面聚合法、层层自组装技术、脂质体技术等。纳米微胶囊选用生物降解聚合物（凝胶等）作为壁材，与传统微胶囊相比，纳米微胶囊因尺寸小且缓释效果明显而具有易被人体吸收的优势[70]，纳米微胶囊在多领域应用广泛，水产加工业中常用乳液聚集法与脂质体技术对鱼油进行微囊化处理，以此保护其功能性成分不被破坏。

乳液聚合法通过加热添加了芯材与乳化剂并形成均匀稳定溶液体系的壁材乳液制得微胶囊。江连洲等[71]选用质量分数2%的大豆蛋白与质量分数0.2%的磷脂酰胆碱为复合乳化剂，利用高压均质技术在鱼油质量分数1.5%、均质压力100 MPa 时制得的鱼油纳米乳液可在4 ℃和25 ℃下稳定储存30 d，且对Na+有一定的抗性，耐碱性高于耐酸性。Zimet 等[72]以低甲氧基果胶和β-乳球蛋白为载体制得的DHA 纳米微胶囊稳定性良好，其有效成分在贮藏过程中损失较小。

纳米脂质载体技术分为2 类：第1 类利用固态脂质与表面活性剂在室温下将有效成分包埋于水相中，该方法稳定性、包封率和载量较高；第2类由固/液多种脂质经加热后结晶制备微胶囊。相较于第1 类脂质体，此类工艺可形成无序结晶，提高包封率和载量的同时降低了贮藏过程中有效成分的损失。Nesa 等[73]制备出大型海藻基纳米脂质体，发现纳米脂质体技术的使用有效延缓了鱼油在30 ℃下的氧化，经纳米脂质体处理的样品色值具有更高的稳定性。Ghorbanzade 等[74]在酸奶中添加鱼油纳米脂质体，贮藏21 d 后与直接补充鱼油的酸奶相比，其含有的EPA 和DHA 更多，表明纳米脂质体包封具有良好的抗氧化性。

2.2 乳状液技术

乳状液可将油脂以液珠的形式包埋在水相中，最终形成一种稳定均一的分散体系，有利于鱼油类液态产品的开发与应用[75]。然而，鱼油乳液对壁材乳化性有一定的要求，长期放置易氧化，不便储存。刘汝萃等[76]分别探讨乳化剂种类、添加量等因素对鱼油乳液稳定性的影响，在蔗糖酯质量占比0.6%、麦芽糊精质量占比8%、油水质量比1∶9时可得到稳定性优良的鱼油乳液。何镇宏等[77]研究发现选用表面活性肽制备的藻油DHA 乳液在高温处理和常温贮存过程中的稳定性较优。Yu等[78]以花生分离蛋白和鱼油为原料制备乳液凝胶（PEG）并将其添加到鱼糜凝胶中，结果表明与直接添加鱼油的对照组相比，含有4%～8% PEG 的鱼糜凝胶在硬度、黏附性和咀嚼性方面有显著改善，且PEG 可均匀地填充蛋白质基质间空隙并形成更为牢固的网络结构。

EPA 和DHA 对人体脑部神经发育、心血管疾病预防等方面具有优良的生理功效，然而较多的双键数目导致其在加工、运输和储存过程中易氧化变质，影响油脂品质，降低商品价值。为使EPA和DHA 在食品加工领域应用更广泛，生物活性物质运载系统应具备成本小、工艺简单、稳定性强、包封率高、损失率低、原料食品级等性质，且为避免功能因子的吸收浪费，运载系统需具备缓释作用。现阶段有关功能性油脂的固态与液态稳态化产品在一定程度上均可实现n-3 PUFA 的高包埋率。然而，不同方法均存在其局限性，喷雾干燥稳定性差；凝聚法、冷冻干燥法成本高；包络结合法反应条件可控性差；凝固浴法产品颗粒大；纳米微囊化技术、乳状液技术对壁材要求较为苛刻等。相较于传统n-3 PUFA 稳态化技术，纳米微囊化技术所得产品稳定性高，且壁材易降解，芯材的生物利用度高，具有较强的发展潜力。

3 鱼油n-3 PUFA 生物活性

鱼油具有悠久的历史。从公元8 世纪古罗马人普遍食用的从鱼类中提取的补充剂，到工业革命时期用于治疗佝偻病的鳕鱼肝油，再到20 世纪逐渐被认可的PUFA，水产油脂发展至今，其作用已然得到充分的证实。其中，EPA 和DHA 因具有提高免疫力、降血脂、预防心脑血管疾病等功效而受到广泛的研究与应用[79]。

3.1 保护心脑血管

慢性炎症会引发包含心脑血管疾病在内的诸多病症，鱼油n-3 PUFA 中的EPA 和DHA 能激活单核、巨噬等炎性细胞膜上的蛋白受体，通过信号传导、酶表达等作用过程抑制炎症的产生，为心脑血管提供保护机制[80]。Maki 等[81]在14 项随机对照试验的分析中发现，与对照组相比，补充n-3 系脂肪酸可将心血管疾病死亡的风险降低8.0%。

3.2 神经保护功能

60%的神经细胞膜磷脂脂肪酸由DHA 组成，含量丰富。DHA 可改变神经元细胞的膜结构、修饰血-脑脊液屏障功能、阻止神经细胞凋亡并调节神经生长因子，进而保护神经元[82]。n-3 PUFA 在提高记忆力、改善视力、治疗神经疾病方面已获认可。Maria 等[83]通过小鼠实验探究n-3 PUFA 对神经的作用效果，发现n-3 PUFA 处理后的小鼠视网膜神经节细胞和轴突密度均高于相应的未处理组，且视网膜细胞凋亡较少，表明n-3 PUFA 对小鼠的视网膜具有神经保护作用。

3.3 调节骨代谢

n-3 PUFA 可抑制破骨细胞的生长，增强成骨细胞的活性，增加骨细胞的形成，调节骨质疏松，对骨骼发育、恢复有积极作用。Abshirini 等[84]通过总结细胞培养和动物研究建立的不同作用机制，突出了长链多不饱和脂肪酸对骨细胞和软骨细胞的多种重要作用，表明了n-3 PUFA 调节骨代谢与抗炎机制有关。

3.4 抗肿瘤作用

n-3 PUFA 可通过诱导细胞凋亡与自噬抑制恶性胶质细胞瘤细胞的滋生[85]，DHA 和EPA 均能通过参与调控细胞减少基因表达错误的发生，对细胞膜流动性与细胞修复速率的增加和癌细胞异常增生的抑制均能起到积极作用[86]。

3.5 其它功能

n-3 PUFA 在调节代谢综合征、促进生长发育、改善肌细胞功能等方面的研究同样有所进展。金灿等[87]通过干预试验发现补充n-3 PUFA 能够降低代谢综合征高危人群血压、甘油三酯等风险因子参数，增加高密度脂蛋白，对代谢综合征具有预防作用。杨庆等[88]发现新生儿n-3 PUFA 的缺乏可能会导致神经发育受损，影响新生儿免疫系统并导致其疾病的发生。郭惠兰等[89]发现大剂量补充n-3 PUFA 能够增加老年人（尤其是女性）肌肉质量，提高肌肉力量并改善肌肉功能。