碱性过氧化氢处理对藕渣不溶性膳食纤维结构及功能特性的影响

张 倩，王佩瑶，王子成，黄琳茜，何 玲，徐 磊

（淮阴工学院 生命科学与食品工程学院 江苏淮安 223003）

莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn），一种莲科多年生蔬菜，在我国种植规模较大，具有重要的经济价值[1]。莲藕富含淀粉、膳食纤维（Dietary fiber，DF）、蛋白质、氨基酸、还原糖、矿物质、酚类和维生素等多种营养物质[2]。研究发现，莲藕具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、减肥和抗糖尿病等多种生理作用[3-4]。目前，在我国有超过20%的莲藕被用于藕片、藕粉、藕汁和藕醋等的生产加工，在生产过程中产生大量的藕节、藕渣等废料，除少量被用作饲料，大部分被废弃，一定程度上造成了莲藕资源的浪费，约束了其经济价值的提升[2]。研究表明，藕渣保留了莲藕的许多功能性成分，尤其含有丰富的DF，对其进行综合利用，一方面可以提高莲藕种植的经济效益，另一方面也可以拓宽食品和药品行业原材料的来源[5]。

DF 是一种在植物中发现的碳水化合物聚合物，它虽难以消化和吸收，但是人类饮食的重要组成部分，也是肠道微生物群落的重要基质[6]。根据DF 其水溶性可分为可溶性膳食纤维（Soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（Insoluble dietary fiber，IDF）。虽然DF 的主要部分为IDF，但是通常情况下IDF 的物理和生理活性弱于SDF。为了充分利用DF，对IDF 进行一定的改性，被认为是一种有效的营养提升策略[7]。研究表明，酶[8]、发酵[9]、物理[10]和化学[11]等手段可以改变IDF的结构，提高其物理和生理活性。碱性过氧化氢（Alkaline hydrogen peroxide，AHP）为一种经典的木质纤维素预处理方法，可以降低木质纤维素抗酶水解能力，从而提高其生物利用度[12]。在AHP处理过程中只产生氧气和水，不会造成二次污染。目前，AHP 被用于处理荞麦秸秆[13]和人参渣[7]来源的IDF，结果表明：AHP 处理改变了IDF 的理化和功能特性。然而，AHP 处理对藕渣IDF 结构和功能特性的影响尚未有报道。

本研究以藕渣为原料，采用AHP 法制备IDF，测定IDF 的持水力、持油力、膨胀力、吸附性等功能性质，分析单糖组成、微观结构、红外光谱、X-射线衍射图谱和热稳定性，以探究AHP 处理对藕渣IDF 的功能及结构特性的影响，为藕渣DF的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藕渣为本实验室自制。新鲜莲藕购自当地农贸市场，将莲藕切成碎丁，加入去离子水后置于高速组织捣碎机中打浆，然后采用双层纱布过滤除去淀粉，将滤渣于45 ℃烘箱干燥24 h，粉碎过100目筛后备用。

α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、单糖标准品，美国Sigma-Aldrich 公 司；碱性蛋白酶，丹 麦Novozymes 公司；过氧化氢、HCl、NaOH、乙醇、冰乙酸等，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要设备及仪器

ICS3000 离子色谱仪，美国Dionex 公司；SU8010 型场发射扫描电镜，日本日立高新技术公司；Scientific Nicolet iS5 型红外光谱仪，美国Thermo 公司；Smartlab 9KW 型X-射线衍射，日本理学株式会社；STA449F3 同步热分析仪，德国耐驰仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藕渣的AHP 处理 准确称取藕渣100 g，按料液比1∶15 加入1%过氧化氢溶液，采用1 mol/L NaOH 溶液调节pH 值至11.0，然后于60℃水浴搅拌反应2 h。待反应结束后，用1 mol/L HCl 溶液调节pH值至7.0，按体积比1∶3 加入95%乙醇，4 000 r/min 离心10 min 收集沉淀，将沉淀于45 ℃烘箱干燥24 h，粉碎过100 目筛，得到AHP 处理藕渣。

1.3.2 藕渣IDF 的制备 称取藕渣100 g，按料液比1∶15 加入去离子水，调节pH 值至8.2，充分搅拌后加入0.5 mL α-淀粉酶，95 ℃反应30 min。待悬浮液冷却到60 ℃后，加入0.5 mL 碱性蛋白酶，反应30 min 后调节pH 值至4.5，接着加入0.1 mL 淀粉葡萄糖苷酶，反应30 min。反应结束后，沸水浴灭酶，待悬浮液冷却至室温，离心收集沉淀，于45 ℃烘箱干燥24 h，粉碎过100 目筛，得IDF。

1.3.3 单糖组成测定 参照Liu 等[14]的方法，采用离子色谱法分析藕渣IDF 的单糖组成。准确称取0.2 g IDF，加入2 mL 浓硫酸，混匀后反应1 h，接着加入56 mL 去离子水，密封后于121 ℃反应2 h，待冷却后用CaCO3中和硫酸，然后于10 000 r/min 离心20 min。上清液过0.22 μm 滤膜后进行上样分析，液相系统采用CarboPac PA-1（4 mm ×250 mm）色谱柱，流动相为0.025 mol/L NaOH 溶液，控制流速为0.25 mL/min，柱温为30 ℃。

1.3.4 扫描电子显微镜分析 取适量藕渣IDF，采用导电胶带固定后用真空溅射镀金，然后置于扫描电子显微镜下观察。测试加速电压为15 kV，放大倍数分别为500 和10 000。

1.3.5 傅里叶红外光谱分析 取适量藕渣IDF，按1∶100 的比例加入KBr，充分研磨粉碎后压成透明薄片，然后放入傅里叶红外光谱仪中扫描，波数范围为400～4 000 cm-1。

1.3.6 X-射线衍射分析 取适量藕渣IDF，均匀铺展于样品槽中，压平后在X-射线衍射仪上进行扫描，试验条件：靶型为Cu-Ka 靶，扫描范围（2θ）为5°～60°，扫描速度为5°/min。

1.3.7 热重分析 称取5 mg 左右藕渣IDF 置于坩埚中，以10 ℃/min 的升温速度将样品从30 ℃加热到600 ℃，选择氮气作为保护气，控制流速为50 mL/min。

1.3.8 理化性质测定

1.3.8.1 持水力的测定 准确称取0.2 g IDF（m0）于10 mL 离心管中，加入6 mL 去离子水，振荡均匀，室温下静置24 h 后于4 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，用滤纸吸干管壁残余水滴，分别记录空离心管质量（m1）和吸水后样品和离心管总质量（m2），按式（1）计算持水力。

1.3.8.2 持油力的测定 准确称取0.2 g IDF（m0）于10 mL 离心管中，加入6 mL 玉米油，振荡均匀，室温下静置24 h 后于4 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，用滤纸吸干管壁残余油滴，分别记录空离心管质量（m1）和吸油后样品和离心管总质量（m2），按式（2）计算持油力。

1.3.8.3 膨胀力的测定 准确称取0.2 g IDF（m）于10 mL 离心管中，记录干样体积（V1），加入6 mL 去离子水，搅拌均匀，室温下静置24 h，记录膨胀后样品体积（V2）。

1.3.9 吸附性能测定

1.3.9.1 亚硝酸钠吸附能力测定 参考Zhang 等[15]的方法并略作修改，准确称取0.3 g IDF 于100 mL 锥形瓶中，加入30 mL 100 μmol/L NaNO2溶液，然后调节体系pH 值至7.0，在37 ℃摇床中恒温振荡2 h，离心取上清液，采用盐酸萘乙二胺法在波长550 nm 波长处测定吸光度，并以亚硝酸钠为标准品绘制标准曲线。

1.3.9.2 胆固醇吸附能力测定 参照陈致印等[16]的方法进行胆固醇吸附能力的测定，略作修改。准确称取IDF 0.3 g 于100 mL 锥形瓶中，加入8 mL冰乙酸饱和2 h，然后加入20 mL 0.5 mg/mL 的胆固醇溶液。将上述溶液置于25 ℃摇床中，以200 r/min 振荡1.5 h，然后于4 000 r/min 离心10 min。取上清液稀释5 倍，采用邻苯二甲醛法在波长550 nm 处测定吸光度值，并以胆固醇为标准品绘制标准曲线。

1.3.9.3 Cu2+吸附能力测定 参照Zheng 等[11]的方法，准确称取0.2 g IDF 于100 mL 锥形瓶中，加入25 mL 4 mg/mL 的CuSO4溶液，于37 ℃摇床中以160 r/min 振荡24 h，然后于4 000 r/min 离心10 min。采用碘量法测定上清液中Cu2+的含量，并以未吸附前的CuSO4溶液作为对照。

1.3.10 阳离子交换能力测定 参照万仁口等[17]的方法，准确称取1 g IDF 于100 mL 锥形瓶中，加入20 mL 0.1 mol/L 的HCl 溶液，充分搅拌后密封静置12 h。过滤悬浮液，将滤渣用蒸馏水反复冲洗直至滤液中不含Cl-（10% AgNO3作指示剂），然后向滤渣中加入100 mL 5% NaCl 溶液，搅拌混匀30 min，用0.01 mol/L NaOH 溶液滴定（酚酞作为指示剂），并以去离子水代替HCl 做空白试验。

1.4 数据分析

每组试验至少重复测定3 次，使用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，P<0.05 表示显著性差异，并用Origin 2022 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 藕渣IDF 的单糖组成

AHP 处理对藕渣IDF 的单糖组成的影响如表1 所示。未处理IDF 主要由8 种单糖组成，其中D-葡萄糖、半乳糖醛酸和D-半乳糖质量分数较高，而D-木糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖质量分数较低。刘恩超等[18]报道称藕皮、藕节和藕食用部位多糖均主要由D-葡萄糖和D-半乳糖构成。纤维素主要由葡萄糖单元聚合而成，果胶主要由半乳糖醛酸和D-半乳糖等构成，而半纤维素则由多种单糖混聚而成[19]，与本研究结果相符。由此可以看出，藕渣IDF 主要由纤维素和果胶类物质构成。与未处理IDF 相比，经AHP 处理后，D-木糖和L-阿拉伯糖在IDF 中未检出，D-葡萄糖质量分数增加了9.52%（P<0.05），而其它单糖质量分数均显著降低（P<0.05）。AHP 处理后D-葡萄糖质量分数增加而其它单糖质量分数降低可归因于处理过程中果胶、半纤维素的溶解，从而提高了藕渣IDF 中纤维素的比例。在碱性pH 值下，过氧化氢不稳定，可以形成超氧和羟自由基，导致藕渣DF 的部分降解[7]。Meng 等[13]在采用AHP 法处理荞麦秸秆IDF过程中也报道了显著提高的D-葡萄糖含量。

表1 藕渣IDF 的单糖组成Table 1 Monosaccharide compositions of insoluble dietary fiber from lotus root residue

2.2 藕渣IDF 微观结构

利用SEM 对AHP 处理前、后的藕渣IDF 微观结构进行观察，结果如图1 所示。未处理IDF 的结构紧凑、完整，表面较光滑，整体呈团块状（图1a、1b），而经AHP 处理后IDF 的致密结构被破坏，呈现疏松多层的蓬松结构，表面起皱并出现解离断裂，碎片尺寸减小（图1c、1d）。藕渣IDF 结构的变化可归因于AHP 的促进半纤维素降解和脱木质素作用[20]。Meng 等[13]在采用AHP 方法提取荞麦秸秆IDF 时也发现了类似的现象。AHP 处理后藕渣IDF 增大的表面积，此可在一定程度上促进其功能性质的提高。

图1 藕渣IDF 的扫描电镜图Fig. 1 Scanning electron microscopy of insoluble dietary fiber from lotus root residue

2.3 藕渣IDF 的红外光谱分析

AHP 处理前后、藕渣IDF 的FTIR 如图2 所示，AHP 处理后未出现明显的新的化学基团。IDF在3 385 cm-1和3 386 cm-1附近的宽吸收峰可归因于O-H 的伸缩振动，主要来自半纤维素和纤维素。2 916 cm-1和2 913 cm-1附近出现的较弱吸收峰，这是由多糖的甲基和亚甲基的C-H 伸缩振动所引起。未处理IDF 在1 733 cm-1处出现一较弱吸收峰，是由酯类C=O 的拉伸振动所引起，然而AHP 处理后IDF 此处的吸收峰消失，这可能是由于AHP 处理时的氧化作用所致[21]。Liu 等[14]在采用AHP 法提取甘薯渣DF 时也报道了类似的现象。此外，1 251 cm-1处的吸收峰可能与C-O 的伸缩振动有关，然而，在AHP 处理后此处的吸收峰明显减弱。在1 620 cm-1和1 616 cm-1附近的强吸收峰可归因于-COOH 的伸缩振动。在1 058 cm-1处的吸收峰与C-O-C 的伸缩振动有关，而在896 cm-1处的吸收峰与β-糖苷键的伸缩振动有关[10]。以上FTIR 结果表明AHP 对藕渣IDF 的改性作用主要是破坏纤维素、半纤维素和木质素的链内、链间的特定化学键。

图2 藕渣IDF 的红外光谱图Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of insoluble dietary fiber from lotus root residue

2.4 藕渣IDF 的X-射线衍射分析

采用X-射线衍射技术对藕渣IDF 的晶体结构类型和结晶度进行表征，结果如图3 所示。未处理IDF 在2θ 为21.94°处观察到一个尖锐的晶体衍射峰，在2θ 为15.43°和34.64°处分别显示出较弱的晶体衍射峰，这表明未处理IDF 呈现典型的纤维素I 型晶体结构[22]。研究表明，IDF 的有序结晶区主要由纤维素构成，而无序非结晶区主要由非晶纤维素、半纤维素和木质素等组成[23]。经AHP处理后藕渣IDF 的衍射峰位置未发生变化，表明AHP 处理未改变IDF 的晶体类型。然而，所有衍射峰的强度均显著提高，经AHP 处理后藕渣IDF 的相对结晶度从13.09%增加到16.13%（P<0.05），这可能是由于非晶形半纤维素、木质素等物质的降解所致[24]。在AHP 处理过程中藕渣IDF 中化合物之间的分子链接会被打破，位于非结晶区的物质更易被水解，从而提高结晶区域所占的比例。上述结果与Jiang 等[7]采用AHP 处理人参IDF 的结果吻合。

图3 藕渣IDF 的X-射线衍射图Fig. 3 X-ray diffraction diagrams of insoluble dietary fiber from lotus root residue

2.5 藕渣IDF 热稳定性

采用热重分析法对藕渣IDF 的热稳定性进行了分析，样品的热重（TG）和微商热重（DTG）曲线如图4 所示。从TG 曲线可以看出，AHP 处理前后藕渣IDF 显示出相似的失重规律：第1 阶段（50～150 ℃），IDF 的质量缓慢降低，主要由亲水基团吸附的水分蒸发引起；第2 阶段（150～400 ℃），IDF的质量迅速下降，主要与纤维素、半纤维素的降解相关；第3 阶段（400～600 ℃），IDF 的质量损失速率减慢，可归因于木质素和一些复杂聚合物的高温降解[25]。最终，未处理IDF 的质量残留率为10.43%，显著低于AHP 处理IDF 的15.94%（P＜0.05）。这与X-射线衍射的结果相一致，AHP 处理后IDF 拥有较高的结晶度，分子链排列程度更有序，因而稳定性更好。Zhang 等[26]研究也发现，采用AHP 法从桔皮中回收的柑橘纤维具有更高的热稳定性。从DTG 曲线可以看出，IDF 的热解区间在AHP 处理后变窄，峰值温度从324.39 ℃降低到305.77 ℃。AHP 处理提高了IDF 的质量残留率，而降低了峰值热解温度，这一方面是由于AHP 处理后IDF 结构松散，在较低的温度下即可被降解，另一方面AHP 处理后IDF 的结晶度提高，热稳定性增强。

图4 藕渣IDF 的热重曲线图Fig. 4 Thermogravimetric curves of insoluble dietary fiber from lotus root residue

2.6 藕渣IDF 的持水力、持油力和膨胀力

AHP 处理对藕渣IDF 持水力、持油力和膨胀力的影响如表2 所示。持水力主要表征材料在一定离心力条件下保持水分的能力[27]。由表2 可知，未处理IDF 的持水力为8.12 g/g，显著高于其它来源的IDF（P＜0.05），如荞麦秸秆[13]（4.97 g/g）和燕麦[10]（2.43 g/g）等。在AHP 处理后藕渣IDF 的持水力显著提高（P＜0.05），较未处理时增加了49.01%。未处理IDF 的持油力为4.50 g/g，显著高于其它来源的IDF（P＜0.05），如小麦（3.63 g/g）和刀豆[27]（2.43 g/g）等。与对持水力的影响类似，AHP 处理显著提高了藕渣IDF 的持油力，较未处理时增加了266.67%。产生上述结果可能是由于AHP 处理使得藕渣IDF 的结构更加蓬松，暴露了更多的亲水和亲油位点，从而增强水和油的物理截留能力。在荞麦秸秆[13]和人参[7]的AHP 处理研究中也观察到IDF 显著增加的持水力和持油力。

表2 藕渣IDF 的持水力、持油力和膨胀力Table 2 Water holding capacity，oil holding capacity and swelling capacity of insoluble dietary fiber from lotus root residue

膨胀力反应一定重量的干物质在过量溶剂中平衡后的体积变化，是一个与溶剂性质、物质结构等诸多因素相关的物理量[28]。未处理IDF 的膨胀力为5.41 mL/g，在AHP 处理后降低了37.89%（P＜0.05）。Meng 等[13]发现AHP 处理可以提高荞麦秸秆IDF 的膨胀力，与本研究结论相反。这可能是由于IDF 的来源不同所致，在本研究中AHP 处理已使藕渣IDF 形成了较为蓬松的结构，在加入水后进一步膨胀有限，因而较未处理IDF 膨胀力降低。

2.7 藕渣IDF 的吸附性能

AHP 处理对藕渣IDF 亚硝酸钠、胆固醇和Cu2+吸附能力的影响如表3 所示。亚硝酸钠作为一种添加剂已被广泛用于多种腌肉制品中，可以赋予产品特征性风味和颜色，同时也可起到抑制某些细菌的作用[29]。然而，在酸性条件下，亚硝酸根离子可与仲胺、酰胺等反应生成具有强烈致癌作用的N-亚硝基化合物[7]。研究发现DF 对亚硝酸盐具有一定的吸附能力，从而有助于降低亚硝酸盐对人类的毒性[30]。未处理IDF 的亚硝酸钠吸附能力为0.86 mg/g，而AHP 处理后未发生显著变化（P>0.05）。这可能是由于一方面AHP 处理使得IDF 更加蓬松，可以吸附更多的亚硝酸根离子，另一方面AHP 处理提高了IDF 的表面负电荷密度，增强了对亚硝酸根离子的排斥。

表3 藕渣IDF 的吸附性能Table 3 Adsorption capacity of insoluble dietary fiber from lotus root residue

胆固醇是心血管疾病的一个重要诱发因子，DF 的胆固醇吸附能力是评估其降血脂特性的重要指标[31]。如表3 所示，未处理IDF 的胆固醇吸附能力为12.26 mg/g，而AHP 处理后显著增大（P<0.05），较未处理时提高了23.49%。经过AHP 处理后，藕渣IDF 的表面更加粗糙，结构相对疏松，这可能为胆固醇提供更多的结合位点。

铜污染是威胁食品安全的严重问题，体内铜过量累积会导致肝硬化、腹泻和其它疾病[32]。研究表明，DF 的羧基、羟基和酚酸等基团都对Cu2+有较强的吸附能力，适当的化学和物理改性均可提高DF 的Cu2+吸附能力[11]。未处理IDF 的Cu2+吸附能力为85.12 mg/g，而AHP 处理后显著提高（P<0.05），较未处理时提高了5.56%。AHP 处理后藕渣IDF 结构变得疏松，以及引发的化学键解离，都可在一定程度上促进IDF 对Cu2+的捕获和吸附能力提高。

2.8 藕渣IDF 的阳离子交换能力

AHP 处理前、后藕渣IDF 的阳离子交换能力的变化如图5 所示。未处理IDF 的阳离子交换能力为1.40 mmol/g，而AHP 处理后显著提高（P<0.05），较未处理时提高了7.86%。DF 的侧链结构中含有的羧基、氨基和酚羟基基团都可以赋予其一定的弱酸性阳离子交换作用，摄入到机体后能起到保持肠道pH 值稳定，控制离子浓度平衡，调节渗透压等作用[33]。AHP 处理后，IDF 的比表面积增大，分子内共价键断裂，使更多能进行阳离子交换的基团暴露出来，因而阳离子交换能力越强。

图5 藕渣IDF 的阳离子交换能力Fig. 5 Cation exchange power of insoluble dietary fiber from lotus root residue

3 结论

经AHP 处理后藕渣IDF 的单糖组成发生变化，D-葡萄糖质量分数增加而其它单糖质量分数降低。藕渣IDF 结构在AHP 处理后变得更加疏松，FTIR 图谱中部分特征峰消失或减弱，官能团结构发生变化。AHP 处理降解了藕渣IDF 的非结晶区域，因而其相对结晶度提高，藕渣IDF 经AHP处理后热解峰值温度虽然降低，但质量残留率提高。此外，藕渣IDF 内部亲水和亲油基团在AHP处理后暴露，使其持水力、持油力、胆固醇吸附能力、Cu2+吸附能力和阳离子交换能力均显著提高。本研究结果可为藕渣IDF 的功能性质改善及其在食品加工中的应用提供理论参考。