高浓度柴油降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

王朝辉，曹 青，李 怿，李 磊，王飞龙，白正伟，贾 苒

(1.中石化炼化工程(集团)股份有限公司洛阳技术研发中心，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学基础医学与法医学院)

石油被誉为“工业血液”,在人类生活和社会发展中扮演着重要的角色。然而在石油开采、炼化、贮存、运输、使用过程中经常会发生原油及各类油品的泄漏,导致土壤、地表水和地下水的污染[1-4]。石油烃污染物具有疏水性、迁移能力强和难生物降解等特征,进入土壤后很难被快速清除,将长期存在于土壤与地下水中,对微生物、动物、植物构成危害,并随着食物链进入人体,损害人类健康[5-6]。因此,亟需对石油烃污染的土壤和地下水开展修复。

石油烃污染场地的修复技术主要有物理修复、化学修复、生物修复以及联合修复等[7-9]。其中微生物修复技术具有成本低、操作简便、无二次污染、对污染场地土壤扰动小、工程量小等优点,引起了广泛的关注[10-11]。能降解石油类物质的微生物种类繁多、数量庞大,但其中有关鲍特氏菌属(Bordetella)的报道相对较少,且大多只针对卤代烃、多环芳烃类污染物进行了研究。Wang Fang等[12]发现了两株鲍特氏菌,其能够在以1,2,4-三氯苯为唯一碳源的培养基中快速生长并起到良好的降解作用。Abo-State等[13]发现禽鲍特氏菌能够有效地将萘降解为邻苯二甲酸、1-壬烯-3-醇以及环氧乙烷等生物毒性较低的中间产物。Patel等[14]发现,通过将鲍特氏菌和假单胞菌、固氮弧菌等构建成降解菌群,对萘、菲、氟蒽和芘等多环芳烃表现出了良好的降解能力。

现有研究大多只报道了鲍特氏菌对氯代烃和多环芳烃的降解能力,对柴油类石油烃的降解研究鲜有报道,因此针对鲍特氏菌进行柴油降解研究可为该菌属应用于石油烃污染土壤和水体的生物修复提供有力支撑。本研究从某石油化工退役场地石油烃污染土壤中筛选得到一株对柴油具有降解性能的鲍特氏菌,将其命名为Bordetellasp.T3(简称T3)。对T3菌株进行鉴定和形态结构表征,考察菌株的生长特性及以对柴油污染物耐受程度和降解特性,确定最适的降解条件,以期为高浓度柴油污染的生物修复和工业化菌剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌 种

从某石油化工退役场地的石油烃污染土壤中筛选分离得到。

1.2 原料与试剂

NH4Cl,分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司产品;FeSO4·7H2O,分析纯,南京化学试剂股份有限公司产品;NaCl,分析纯,西陇科学股份有限公司产品;CaCl2,分析纯,天津市天达净化材料精细化工厂产品;K2HPO4和KH2PO4,均为优级纯,天津市大茂化学试剂厂产品;琼脂,生物试剂,德国Biofroxx生物试剂公司产品;胰蛋白胨和酵母浸粉,均为生物试剂,OXOID公司产品;正己烷,分析纯,美国Fisher Chemical公司产品。

0号国Ⅵ车用柴油(简称0号柴油),购自中国石化销售股份有限公司贵州贵阳石油分公司。

1.3 培养基

无机盐培养基:NH4Cl 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 2 g,CaCl20.1 g,K2HPO41 g,KH2PO41 g,去离子水1 L,pH 7.0。

柴油平板培养基:在无机盐培养基的基础上添加20 g/L琼脂和2 mL 0号柴油。

柴油培养基:若无特别说明,均为无机盐培养基中添加体积分数1%的0号柴油。

LB培养基:胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母浸粉5 g,去离子水1 L,pH 7.0。

1.4 柴油降解菌的分离纯化

从某石油化工退役场地采集石油烃污染土壤作为菌株筛选材料,称取污染土壤10 g,放入锥形瓶中,加入90 mL无菌水制备成水土混合液,置于30 ℃摇床中以160 r/min的转速振荡1 h使土样中的细菌分散于水中,静置30 min,上层清液即稀释倍数为10的菌悬液。取稀释倍数10的菌悬液,先分别稀释至倍数为102,103,104倍,然后分别吸取50 μL稀释倍数为102,103,104的菌液均匀涂布于柴油平板培养基中,37 ℃培养3～5 d,挑取不同菌落形态的单菌落分别接种于LB培养基中振荡培养[15]。连续培养3次后吸取50 μL菌液接种到柴油培养基中,接种量(φ)为0.1%,7 d后测定柴油的降解率,降解率最高(初始柴油降解率为36.91%)的菌株为T3。以T3进行后续试验。

1.5 降解菌的形态学及分子生物学鉴定

采用16S rRNA序列分析方法鉴定T3菌株,由华大基因生物科技有限公司完成。

菌落的生长状况以及形态特征测试按照《常见细菌系统鉴定手册》进行初步判定,并采用扫描电子显微镜(型号Hitachi S3400N)在10 000倍下观察,测序结果用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件NCBI中的已知序列进行同源性比对,利用MEGA11.0软件构建系统发育树。菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为CCTCC M 20211642。

1.6 柴油降解率的测定

以正己烷为萃取剂,采用液液萃取的方法,萃取柴油培养基中的柴油,萃取后柴油含量通过气相色谱仪(型号Agilent 6890N)进行测定。采用Agilent HP-5色谱柱,规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm。仪器设置条件为:进样口温度320 ℃,不分流进样;柱箱初始温度50 ℃,保持2 min,以40 ℃/min的速率升至230 ℃,以20 ℃/min的速率升至320 ℃,保持20 min。载气为氦气,气体流速为2.0 L/min:氢火焰离子化(FID)检测器;进样量1 μL。

式中:ρ0是未接种菌的柴油培养基中柴油的质量浓度,mg/L;ρ1是接种菌后柴油培养基中柴油的质量浓度,mg/L。

1.7 降解菌生长曲线的测定

以LB培养基为参比,利用紫外分光光度计在光波波长为600 nm条件下测定菌悬液的吸光度(OD600),通过测定的OD600间接反映T3的生长量。

将T3以接种量(φ)为0.1%接种在LB培养基中,30 ℃、160 r/min震荡培养。0～20 h,每隔2 h取样;20 h后,每隔4 h取样,连续取到40 h。以LB培养基为参比测定OD600值,即可得到降解菌在该条件下的生长曲线。

1.8 影响柴油降解因素试验

1.8.1接种量

将在LB培养基中培养24 h的T3菌液以接种量(φ)分别为0.5%,1.0%,2.0%,5.0%,10.0%接种于柴油培养基中,在30 ℃、160 r/min条件下振荡培养7 d,以不接种菌的柴油培养基为对照,测定降解菌的OD600及柴油降解率。

1.8.2环境条件

将T3以接种量(φ)为2%接种至柴油培养基中,考察温度(20,25,30,35,40 ℃)、体系初始pH(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)、外加氮源(氯化铵、尿素、蛋白胨、硝酸钠,投加质量浓度均为1.0 g/L)、柴油体积分数(0.5%,1%,2%,5%,10%)等因素对降解菌生长和降解效果的影响。所有试验组的降解条件均为30 ℃、160 r/min振荡培养7 d,以不接种菌的柴油培养基作为空白对照,测定菌株的OD600及柴油降解率。

2 结果与讨论

2.1 降解菌的分离与鉴定

通过柴油平板培养基筛选和分离得到一株柴油高效降解菌T3,其菌落形态和扫描电子显微镜照片如图1所示。由图1可知:菌落形态为圆形,白色,表面湿滑不透明,边缘整齐;降解菌为短棒状结构。

图1 降解菌T3的形态

以菌株T3的DNA为模板,利用通用引物扩增得到1 039 bp的16S rRNA基因片段。通过在基因序列数据库中比对分析,发现其与Bordetellapetriistrain DSM 12804的同源性达99.03%。将菌株T3与鲍特氏菌进行系统发育分析(如图2所示),菌株T3的16S rRNA基因序列GenBank登录号为OM149383。

图2 降解菌T3基于16S rRNA基因序列的系统发育分析形态

2.2 降解菌的生长特性

T3在LB培养基中的生长情况如图3所示。由图3可以看出:在0～6 h内,T3处于延滞期,生长缓慢,需要经过一段时间才能在培养基中生长繁殖;6～24 h为对数增长期,细胞代谢活力最强,合成新细胞物质的速率最高,T3数量快速增加,24 h达到最大值的时期;24～32 h为稳定期,此时培养基营养成分浓度降低,同时代谢产物的大量积累对菌体本身产生毒害,这些因素对其生长不利,因此T3的生长趋于稳定;32～40 h为衰亡期,培养基的营养物质大量耗尽,T3开始出现死亡、自溶,细菌生长受到抑制,死亡速率大于生长速率,总细胞数呈负增长。因此后续降解试验均采用在LB培养基中生长24 h左右的菌液。

图3 降解菌T3生长曲线

2.3 接种量对柴油降解率的影响

接种量是影响微生物代谢过程的一个重要因素,影响到微生物的生长速度和延滞期。在柴油体积分数为1%、温度为30 ℃、体系初始pH为7.0的条件下,考察了接种量对T3降解柴油的影响,结果见表1。由表1可知,随着接种量逐渐提高,T3降解柴油降解率和OD600呈现出先增加而后降低的趋势,在接种量(φ)为2%时,对柴油的降解率最高,达到79.04%,OD600也达到0.848。此结果表明,单纯提高接种量并不能显著提升菌株的柴油降解率,接种的微生物过多,使菌体过度繁殖,菌体对培养基中营养物质的相互竞争将造成营养短缺,其代谢活动受到限制,影响微生物对柴油的降解[16]。因此后续试验均选择接种量(φ)为2%进行。

表1 接种量对T3降解柴油效果的影响

2.4 环境条件对柴油降解率的影响

在柴油体积分数为1%、T3接种量(φ)为2%、体系初始pH为7.0的条件下,考察温度对T3降解柴油性能的影响,结果如图4所示。在柴油体积分数为1%、T3接种量(φ)为2%、温度30 ℃的条件下,考察了体系初始pH对T3降解柴油性能的影响,结果如图5所示。

图4 温度对T3降解柴油性能的影响

图5 初始pH 对T3降解柴油性能的影响

由图4可以看出,在柴油培养基中,T3在30 ℃时的柴油降解率最高,达到79.04%,OD600也达到0.848。微生物对柴油的降解属于酶促反应,在最适温度下微生物生长最好,酶活性较高,可促进对柴油的降解,而后温度的升高或降低均会抑制微生物的代谢活动,从而导致T3的生长和柴油降解能力下降。由5可知,在pH为7.0～9.0范围内柴油降解率可达到70%以上,其中pH为8.0时降解率最高,为89.79%,说明T3适宜在pH 为7.0～9.0的弱碱性环境中生长代谢。pH为4.0～6.0的酸性条件不利于T3的生长,从而导致柴油降解率降低。

图6 氮源对柴油降解率的影响

在T3接种量(φ)为2%、温度为30 ℃、体系初始pH为8.0、以氯化铵作为外加氮源的条件下,考察T3对不同浓度柴油的降解能力,结果如图7所示。由图7可以看出,当柴油体积分数为0.5%时,T3生长增殖能力强,柴油降解率达到92.50%。随着柴油浓度的增加,T3的生长速率和柴油降解能力不断下降,主要原因是柴油浓度增大后,会在培养接表面形成一层油膜,使得溶解氧浓度降低,此外高浓度柴油具有一定的生物毒性,抑制了微生物的生长代谢,从而降低了对柴油的降解能力[17]。在柴油体积分数为10%(质量浓度为84 000 mg/L)的条件下,其降解率约40%,说明T3对高浓度柴油污染物具有一定的降解能力,展示出了在高浓度柴油类石油烃污染土壤和地下水的应用潜力。主要原因可能是该降解菌长期在高浓度石油烃和多环芳烃污染的土壤中生长,对该环境条件具有较好的耐受能力。

图7 柴油含量对柴油降解率的影响

2.5 柴油降解机制分析

长期在石油烃、多环芳烃污染土壤中生长使菌株可耐受石油烃污染环境,从此环境中筛选得到的菌株T3也由此具备了良好的石油烃污染环境耐受性与降解能力。在最适宜条件下,采用T3对柴油培养基中体积分数为1%的柴油进行7 d降解,对降解前后的柴油进行气相色谱分析,二者的气相色谱图谱对比见图8,二者的组分含量对比见表2。由图8和表2可以看出,降解7 d后,T3对柴油中的主要组分(C10～C22)均具有较好的降解效果,降解前后柴油各单一组分含量均发生了明显的变化。

表2 柴油降解前后的主要组分含量对比

图8 柴油降解前后的气相色谱

3 结 论

(1)从某石油化工退役场地石油烃污染土壤中筛选得到鲍特氏菌Bordetellasp.T3菌株,其具有良好的高浓度柴油污染物的耐受能力和降解效果。

(2)在柴油体积分数为1%、接种量(φ)为2%、温度为30 ℃、pH为8.0的条件下,采用T3降解柴油7 d降解率可达89.79%。且T3能够耐受体积分数为10%(质量浓度为84 000 mg/L)的柴油,具有约40%的降解率,对高浓度柴油污染情况的生物修复具有重要的意义。

(3)T3可降解柴油中主要的碳氢化合物组分(C10～C22),在柴油等石油烃污染修复领域具有良好的应用价值。