益智对TREM2 调控小胶质细胞表型转化的调节作用

彭 景，杨云方，张 悦，吴 博，贾 英，颜廷旭

（沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院，辽宁 沈阳 110016）

小胶质细胞在神经系统性疾病的发生、发展和终止过程中起着重要调节作用，活化的小胶质细胞有M1 型（促炎性） 和M2 型（抗炎型） 2 种表型［1］。M1 型小胶质细胞会诱导肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（iNOS） 等促炎细胞因子及促炎蛋白释放量的增加，它们均为M1 型小胶质细胞激活的标记物［2-3］。活化的M2 型小胶质细胞会促进抗炎介质白细胞介素-10 （IL-10）、精氨酸酶-1 （Arg-1） 等以及神经营养因子的表达，从而促进神经系统的恢复和重塑进行神经保护，这些蛋白也均为M2 型小胶质细胞标记物［4-7］，且这些促炎和抗炎介质的水平反应了小胶质细胞的激活状态。在正常生理条件下，小胶质细胞呈现一种相对静止的监测表型，然而当免疫稳态受到干扰或神经炎症发生时，小胶质细胞就会进行无数次涉及细胞表型的调节过程，并分泌多种细胞因子以反映脑内状态［8-10］。研究表明，益智提取物可以通过抑制神经炎症发挥神经保护作用［11-16］。但目前没有关于益智是否可以抑制M1 型小胶质细胞活化并促进M2 型小胶质细胞激活的相关研究。故本实验以益智为研究对象，探讨其对小胶质细胞表型转化的调节作用，以期为其深入研究提供参考。

1 材料

1.1 药物 益智购于北京同仁堂辽宁药店有限责任公司，产地海南，生产厂家为亳州市京皖中药饮片厂，经沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院贾英教授鉴定为Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果实。

1.2 细胞 小鼠神经胶质细胞BV2 由沈阳药科大学续繁星老师提供。

1.3 试剂 DMEM 高糖培养基、BCA 蛋白定量试剂盒、放射性免疫沉淀分析 （RIPA） 裂解液、苯甲基磺酰氯（PMSF） 蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂复合物（×100）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）快速配制试剂盒、超敏ECL 发光剂、BSA、脂多糖（LPS）购自大连美仑生物技术有限公司（批号MA0212、MA0082、MA0153、MA0001、MB12707-1、MA0159、MA0186、MB4219、MB5198）； 上样缓冲液（5×） 购自上海碧云天生物技术有限公司（批号P0015L）； Arg-1 抗体、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K） 抗体、蛋白激酶（Akt） 抗体、磷酸化蛋白激酶 （p-Akt） 抗体购自美国ProteinTech 公司 （批号66129-1-Ig、67121-1-Ig、60203-2-Ig、66444-1-Ig）； 钙离子结合受体分子-1 （Iba-1） 抗体、iNOS 抗体、β-actin 抗体、FITC 山羊抗兔、CY3 山羊抗兔、488 山羊抗兔购自英国Abcam 公司（批号ab178846、ab178945、ab8226、ab6717、ab6939、ab150077）； siRNA 转染试剂购自长春金传科技有限公司（批号R19425015）。

1.4 仪器 CO2恒温培养箱、生物超净工作台、Spectra Max M2 型多功能酶标仪（美国Thermo 公司）； 冷冻离心机、高压灭菌锅（长沙市湘仪离心机仪器有限公司）； 转膜装置、电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 益智提取物制备 取益智粉碎，过4 号筛，95%乙醇回流提取3 次（液料比10 ∶1），每次2 h，用八层纱布过滤提取液，减压旋蒸、干燥，得益智干燥浸膏，得率16.47%，于凉暗处保存。取适量浸膏溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS） 中，制成质量浓度为1 mg/mL （生药量） 的溶液，分装于0.5 mL EP 管中，－20 ℃避光储存。取适量LPS 溶于DMSO 中，制成质量浓度为5 mg/mL 的溶液，分装于0.5 mL EP 管中，－20 ℃避光保存。

2.2 细胞培养 将于－80 ℃或液氮中冷冻保存的BV2 小胶质细胞复苏后，取细胞培养瓶于显微镜下观察，当BV2 细胞贴壁生长至培养瓶底面积的90%时进行传代，传代后于细胞培养箱中培养。选择生长状态良好的细胞冷冻保存，条件为4 ℃30 min，－20 ℃1 h，－80 ℃冷冻。以复苏后的细胞作为第一代细胞，选择第3 ～15 代BV2 小胶质细胞进行实验。

2.3 MTT 法检测细胞活力 取BV2 细胞，以1×104/mL 密度接种于无菌96 孔板中，培养24 h。待细胞长至96 孔板底面积的70%时，设置对照组、模型组和给药组，每组3个复孔，继续培养4 h，除对照组外，每孔均加入5 mg/mL LPS，使其质量浓度为1 μg/mL，继续培养24 h。收集细胞，给药组加入 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 益智提取物溶液。作用24 h 后每孔均加入20 μL MTT （5 mg/mL） 培养4 h，加入100 μL 由SDS 10 g、异丁醇5 mL、10 mol/L HCl 0.1 mL 配制的溶液，于细胞培养箱中培养过夜。次日，将96 孔板放在摇床上快速振荡5 min，待紫色结晶充分溶解，于570 nm 波长处检测吸光度，计算细胞存活率。

2.4 Griess 比色法检测NO 水平 按“2.3” 项下方法处理并收集细胞。取每孔细胞上清液50 μL 转移至另一无菌96孔板中。设置标准曲线组，将3×9 个孔分别加入50 μL 细胞完全培养液，每孔均加入不同体积的标准液，标准曲线组浓度梯度分别为0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。每孔按顺序加入50 μL 2 种显色液，于540 nm 波长处检测吸光度。

2.5 Western blot 法检测iNOS、Arg-1、Akt、p-Akt、PI3K蛋白表达 取BV2 细胞，以5×105/mL 密度接种于无菌6孔板中，培养24 h。按“2.3” 项下方法处理并收集细胞，加入RIPA 裂解液，每孔100 μL，收集蛋白上清液，使用BCA 蛋白定量试剂盒将各组蛋白浓度调整一致，加上样缓冲液混合均匀，沸水加热3～5 min 使蛋白变性。将蛋白经SDS-PAGE 电泳后转移至NC 膜或PVDF 膜上。5% 脱脂牛奶封闭2 h，加入iNOS （1 ∶1 000）、Arg-1 （1 ∶5 000）、Akt （1 ∶800）、p-Akt （1 ∶800）、PI3K （1 ∶1 000）、βactin （1 ∶2 500） 一抗4 ℃孵育过夜。TBST 洗涤3 次，加入相应二抗室温孵育1.5 ～2 h，洗涤3 次。显影、定影、冲洗、晾干，以β-actin 为内参，对各组条带进行分析，计算蛋白相对表达量。

2.6 ELISA 法检测IL-10、TNF-α 水平 按“2.3” 项下方法处理并收集细胞，使用BCA 蛋白定量试剂盒定量，按照相关试剂盒说明书检测IL-10、TNF-α 水平。

2.7 细胞免疫荧光法检测Iba-1、Arg-1 水平 取BV2 细胞，以1×105/mL 密度接种于无菌6 孔板中，待细胞长至96 孔板底面积的6%时，按“2.3” 项下方法处理并收集细胞，去除上清液后每孔加入1 mL PBS，清洗细胞2 次。4%多聚甲醛透化，PBS 清洗3 次。室温下加入5%牛血清白蛋白（BSA） 封闭细胞1 h，每孔加入100 μL Iba-1 （1 ∶300）、Arg-1 （1 ∶400） 抗体，4 ℃孵育过夜，清洗3 次。每孔加入100 μL 二抗稀释液（1 ∶300），室温作用1 h。在暗室中，载玻片上滴加含DAPI 的抗荧光衰减剂2 滴，取出爬片，倒扣至抗荧光衰减剂上，避光条件下使用正置荧光显微镜观察、拍照。

2.8 髓样细胞表达触发受体-2 （TREM2） 转染实验 取BV2 细胞，以1×105/mL 密度接种于无菌6 孔板中，每孔加入完全培养基2 mL，培养24 h，待细胞密度为60%时，将完全培养液更换为基础培养基，继续培养4 h。设置对照组、LPS 组、益智组 （益智提取物＋LPS）、转染对照组（NC＋益智提取物＋LPS）、转染实验组（5 μL TREM2-siRNA＋益智提取物＋LPS）。按照相关试剂盒说明书操作，培养4 h，加入LPS （5 mg/mL） 使每孔LPS 质量浓度为1 μg/mL，继续培养24 h，去除细胞培养液，收集细胞用于实验。

2.9 RT-qPCR 法检测IL-10、Arg-1、TNF-α、Iba-1 mRNA 表达 按“2.3” 项下方法处理并收集细胞，益智给药质量浓度为100 μg/mL，每个浓度设置3 个复孔。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA 并合成cDNA，反应体系为95 ℃35 s，60 ℃30 s，共40 个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.10 统计学分析 通过GraphPad Prism 8 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 益智提取物对BV2 细胞活力的影响 如图1 所示，在0～100 μg/mL 范围内，益智提取物对BV2 细胞的存活率无影响。因此，选择0～100 μg/mL 浓度范围内的益智提取物进行实验。

图1 益智提取物对BV2 细胞活力的影响（±s，n＝3）

3.2 益智提取物对LPS 诱导的BV2 细胞NO 水平的影响 如图2 所示，与对照组比较，1 μg/mL LPS 处理的BV2 细胞中NO 水平升高（P＜0.01）； 与LPS 组比较，3.125 ～25 μg/mL 益智提取物对LPS 诱导的BV2 细胞释放的NO 无抑制作用，当质量浓度为50、100 μg/mL 时，可抑制NO 释放（P＜0.01），并呈剂量依赖性。提示益智提取物可抑制LPS 诱导的BV2 细胞中NO 的释放。因此，选择50、100 μg/mL 益智提取物进行后续实验。

3.3 TREM2-siRNA 序列筛选 本实验设计了3 条TREM2-siRNA 序列，分别标为251、411、430。通过RT-qPCR 和Western blot 法检测TREM2 mRNA 和蛋白表达，筛选抑制TREM2 表达效率最高的序列。如图3 所示，与对照组比较，NC 组（一段不会对目的基因有影响的si-RNA 序列，是TREM2-siRNA 转染组的对照组） 并没有对TREM2 mRNA 的转录产生影响； 与NC 组比较，在TREM2-siRNA的3 个序列中，只有siT2-430 组TREM2 mRNA 的转录被抑制，抑制效率大概为50%； 与对照组比较，NC 组同样没有对TREM2 蛋白表达产生影响（P＞0.05）； 与NC 组比较，siT2-411 组和siT2-430 组TREM2 蛋白的表达均降低（P＜0.05，P＜0.01），其中siT2-430 更加有效地抑制了TREM2蛋白表达。因此，将选择siT2-430 的TREM2-siRNA 进行后续实验。

图3 转染TREM2-siRNA BV2 细胞的TREM2 表达（±s，n＝3）

3.4 益智对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞M1 和M2型标记物mRNA 表达的影响 如图4 所示，与对照组比较，LPS 组BV2 细胞IL-10、Arg-1 mRNA 表达降低（P＜0.01），TNF-α、Iba-1 mRNA 表达升高（P＜0.01）； 与LPS 组比较，益智组BV2 细胞IL-10、Arg-1 mRNA 表达升高（P＜0.01），TNF-α、Iba-1 mRNA 表达降低（P＜0.01）； 与转染对照组比较，转染实验组BV2 细胞IL-10、Arg-1 mRNA 表达降低（P＜0.05，P＜0.01），TNF-αmRNA 表达升高（P＜0.01）。

图4 益智提取物对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞TNF-α、IL-10、Arg-1、Iba-1 mRNA 表达的影响（±s，n＝7）

3.5 益智对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞M1 和M2型标记蛋白表达的影响 如图5 所示，与对照组比较，LPS组Iba-1 蛋白表达增加，Arg-1 蛋白的表达无影响； 与转染对照组比较，转染实验组对Iba-1 蛋白表达的抑制作用和对Arg-1 蛋白表达的促进作用均被部分抑制。如图6 所示，与对照组比较，LPS 组BV2 细胞IL-10、Arg-1 蛋白表达降低（P＜0.01），M1 型标记蛋白TNF-α、iNOS 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与LPS 组比较，益智组BV2 细胞IL-10、Arg-1蛋白表达升高（P＜0.01），TNF-α、iNOS 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）； 与转染对照组比较，转染实验组BV2细胞IL-10、Arg-1 蛋白表达降低 （P＜0.05，P＜0.01），TNF-α、iNOS 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 益智提取物对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞Arg-1、Iba-1 蛋白表达的影响

图6 益智提取物对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞TNF-α、IL-10、iNOS、Arg-1 蛋白表达的影响（±s，n＝7）

3.6 益智对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞PI3K/Akt信号通路的影响 如图7 所示，与对照组比较，LPS 组BV2细胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与LPS 组比较，益智组BV2 细胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与转染对照组比较，转染实验组BV2 细胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），表明益智可通过TREM2 膜蛋白，激活PI3K/Akt 信号通路以调节小胶质细胞表型转化。

图7 益智提取物对LPS 诱导的TREM2-siRNA BV2 细胞PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

4 讨论

小胶质细胞作为中枢神经系统内的巨噬细胞，对神经炎症具有调节作用。本实验发现，益智可以改变M1 和M2型小胶质细胞标记蛋白的表达以调节小胶质细胞表型。有研究表明，TREM2 是一种细胞跨膜蛋白，并且该蛋白高度表达于小胶质细胞中［17］。小胶质细胞的表型转化在很大程度上依赖于TREM2 受体蛋白，该蛋白表达提高后的抗炎作用已经在几种不同的细胞系和组织中得到证实。

通过TREM2-siRNA 转染实验，检测益智对不同表型小胶质细胞标记物Arg-1、Iba-1、TNF-α、IL-10 mRNA 表达以及小胶质细胞标记物蛋白表达的影响。结果表明M1 向M2型小胶质细胞转化是由TREM2 蛋白调控的。TREM2 可以激活PI3K/Akt 通路，促进抗炎细胞因子的表达，从而调节小胶质细胞的表型转化［18-19］。进一步对PI3K/Akt 通路的蛋白表达进行检测，发现益智可能介导TREM2 蛋白进而激活PI3K/Akt 信号通路发挥抗炎作用。

益智为四大南药之一，主要分布于广东和海南。益智含有多种化合物，包括萜类、庚烷类、甾醇类以及具有抗炎生物活性的黄酮类成分，如白杨素和杨芽黄素等［20］。有研究表明，白杨素通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路发挥抗炎作用［21-22］，由此猜测白杨素可能是益智中主要调节小胶质细胞的表型转化的主要成分。但是白杨素是否具有这种作用还需进一步研究验证。