五味子多糖对2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及AMPK/Nrf2/TXNIP 通路的影响

刘枘岢，胡园园，李雯翀，陈毅光

（1.东莞市松山湖中心医院内分泌代谢科，广东 东莞 523326； 2.华中科技大学协和深圳医院内分泌代谢科，广东 深圳 518052）

糖尿病是以高血糖为主要特征的代谢性疾病，其特征是胰岛素分泌不足或对胰岛素代谢作用的敏感性降低。近年来，2 型糖尿病（T2DM） 的患病率在世界范围内不断增加，到2045 年将有大约6.29 亿人患T2DM［1-2］。虽然当前的一些治疗策略可改善T2DM，但它们的副作用和耐受仍不能忽视。五味子是木兰科植物的果实，含有多糖、木脂素等活性成分［3-4］，具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、改善血糖等活性，能降低T2DM 大鼠炎症相关因子肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 和空腹血糖（FBG） 水平，提高空腹胰岛素水平和糖耐量，缓解胰岛素抵抗［5］。胰岛素抵抗是T2DM 的决定性因素［1］，炎症会促进胰岛素抵抗［6］。然而，关于五味子多糖改善胰岛素抵抗的作用机制尚不清晰。单磷酸腺苷激活蛋白酶（AMPK） 在能量转换、葡萄糖代谢、脂肪代谢等过程中发挥作用，激活AMPK 相关通路对于改善T2DM 小鼠机体炎症反应、脂质代谢、胰岛素抵抗具有积极作用［7］。AMPK 磷酸化可促进核因子E2 相关因子2（Nrf2） 激活，降低硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP） 表达，抑制机体炎症反应［8］。本研究旨在探究五味子多糖治疗糖尿病的可能作用机制，以期为临床治疗糖尿病提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级Wistar 健康雄性大鼠，购于省医学实验（广东） 动物中心，实验动物生产许可证号SCXK （粤）2018-0002，鼠龄6 周左右，体质量（170±10） g。分笼饲养，12 h/12 h 昼夜交替，温度25 ℃，相对湿度50%，保持环境清洁。研究遵循“3R” 原则并经东莞市松山湖中心医院动物伦理委员会批准（伦理号2020-0410）。

1.2 试剂 链脲佐菌素 （ STZ）、AMPK 抑制剂dorsomorphin （批号T1507、T1977） 购于上海陶素生化科技有限公司； 五味子多糖（纯度≥95%，批号RH704002）购于上海融禾医药科技发展有限公司； TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 试剂盒，HE 染色试剂盒，BCA 蛋白浓度检测试剂盒（批号PT516、PI328、PI303、C0105S、P0012S） 购于上海碧云天生物科技有限公司； 大鼠胰岛素ELISA 试剂盒、高效RIPA 裂解液（批号SEKR-0033、R0010） 购于北京索莱宝科技有限公司； 兔源AMPK、Nrf2、TXNIP、NLRP3、GAPDH 一抗、羊抗兔IgG 二抗（批号ab32047、ab137550、ab188865、ab263899、ab8245、ab133470） 购于英国Abcam 公司。

1.3 仪器 小动物血糖测试仪（上海玉研科学仪器有限公司）； BX61 显微镜（日本Olympus 公司）； XElx-800 酶标仪（美国Perkin Elmer 公司）； 1659001 蛋白电泳仪、Trans-Blot Wistar 转膜仪（美国Bio-Rad 公司）； GIS-500 凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）。

2 方法

2.1 造模 Wistar 大鼠50 只，随机选取10 只为对照组（常规饲料喂养）； 另40 只构建T2DM 大鼠模型［9］，喂养高脂高糖饲料（63.9% 普通饲料、20% 蔗糖、10% 猪油、5%蛋黄粉、1%胆固醇、0.1%猪胆汁酸钠），喂养8 周后腹腔注射25 mg/kg STZ，72 h 后尾静脉取血，以FBG＞7.1 mmol/L、餐后2 h 血糖（P2BG） ＞11.1 mmol/L 为造模成功。造模过程中出现大鼠死亡或不符合条件的现象，及时挑选备用大鼠进行造模处理。

2.2 分组及给药 将造模成功的大鼠随机分为模型组、五味子多糖组、AMPK 抑制剂组、五味子多糖＋AMPK 抑制剂组，五味子多糖组大鼠每天灌胃给予100 mg/kg 五味子多糖［10］，AMPK 抑制剂组大鼠每天腹腔注射20 mg/kg AMPK抑制剂dorsomorphin［11］，五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠在灌胃给予五味子多糖后腹腔注射dorsomorphin，连续4周，模型组及对照组大鼠给予等体积生理盐水。

2.3 大鼠FBG、P2BG 检测 分别在给药前、给药第2 周、给药第4 周，大鼠禁食12 h，取其空腹尾静脉血，检测FBG、P2BG。

2.4 大鼠胰岛素抵抗相关指标检测 末次给药结束后禁食12 h，取尾静脉血，静置20 min 后低温离心15 min，取血清，按相关试剂盒说明书操作，用ELISA 法检测血清胰岛素水平，计算胰岛素敏感指数（ISI），公式为ISI ＝ln ［1/（血清胰岛素水平×FBG） ］。

每组取4 只大鼠用于胰岛素耐量检测，上午禁食4 h后，腹腔注射胰岛素0.5 U/kg，在注射后30、60、90 min尾静脉取血检测血糖水平。

2.5 HE 染色观察大鼠胰腺组织病理损伤 每组取6 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛后处死，剖开腹腔，分离胰腺，用生理盐水清洗，部分冷冻保存备用； 部分置于10%多聚甲醛中固定48 h，将胰腺组织经过脱水、透明处理后包埋于融化的石蜡中，待其凝固后修剪成合适形状并切成厚度约4 μm 的切片，行HE 染色，按相关试剂盒说明书操作，封片、干燥后于光学显微镜下观察。

2.6 ELISA 法检测大鼠血清炎症因子水平 取“2.4” 项下各组大鼠尾静脉血清，按相关试剂盒说明书操作，检测TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

2.7 Western blot 法检测大鼠胰腺组织AMPK/Nrf2/TXNIP通路相关蛋白表达 取于－80 ℃冰箱保存的大鼠胰腺组织，加入RIPA 组织裂解液制成匀浆，提取胰腺组织总蛋白，采用BCA 蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度并定量，高温加热变性后电泳分离蛋白质，转膜后5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，加入兔源一抗p-AMPK （1 ∶2 000）、AMPK （1 ∶2 000）、Nrf2 （1 ∶500）、TXNIP （1 ∶1 000）、NLRP3 （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次，加入辣根过氧化物标记的二抗，孵育1 h，TBST 洗涤后显色、定影，以GAPDH 为内参，对各组条带进行分析，计算蛋白相对表达量。

2.8 统计学分析 通过SPSS 23.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 五味子多糖对T2DM 大鼠FBG、P2BG 水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05）； 给药第2 周、第4 周，与对照组比较，模型组大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05）； 与模型组比较，五味子多糖组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠FBG、P2BG 水平降低（P＜0.05），AMPK 抑制剂组大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05）； 与五味子多糖组比较，AMPK 抑制剂组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠FBG、P2BG 水平比较（mmol/L，±s，n＝10）

表1 各组大鼠FBG、P2BG 水平比较（mmol/L，±s，n＝10）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与五味子多糖组比较，△P＜0.05。

组别FBG P2BG给药前给药第2 周给药第4 周给药前给药第2 周给药第4 周对照组5.30±1.015.07±0.955.21±1.086.48±1.156.32±1.176.29±1.13模型组19.49±3.06∗16.05±2.54∗16.06±2.38∗22.23±3.46∗17.96±3.45∗16.98±2.54∗五味子多糖组19.50±3.038.18±1.06＃6.97±1.34＃22.38±3.369.49±1.96＃9.03±1.68＃AMPK 抑制剂组19.68±3.6119.44±3.43＃△ 18.97±2.60＃△ 22.03±3.1522.68±3.23＃△22.90±3.53＃△五味子多糖＋AMPK 抑制剂组 19.24±2.8812.36±1.94＃△ 10.18±1.16＃△ 22.30±3.0514.76±1.98＃△13.30±1.68＃△

3.2 五味子多糖对T2DM 大鼠胰岛素抵抗相关指标的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清胰岛素、血糖水平升高（P＜0.05），ISI 值降低（P＜0.05）； 与模型组比较，五味子多糖组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠血清胰岛素、血糖水平降低（P＜0.05），ISI 值升高（P＜0.05），AMPK 抑制剂组大鼠血清胰岛素、血糖水平升高（P＜0.05），ISI 值降低（P＜0.05）； 与五味子多糖组比较，AMPK 抑制剂组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠血清胰岛素、血糖水平升高（P＜0.05），ISI 值降低（P＜0.05），见表2、图1。

图1 各组大鼠血糖水平比较（±s，n＝10）

表2 各组大鼠血清胰岛素水平及ISI 比较（±s，n＝10）

表2 各组大鼠血清胰岛素水平及ISI 比较（±s，n＝10）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与五味子多糖组比较，△P＜0.05。

组别血清胰岛素/（mIU·L－1）ISI 值对照组56.89±5.58－5.69±0.18模型组75.21±7.38∗－7.08±0.28∗五味子多糖组62.40±6.10＃－6.07±0.25＃AMPK 抑制剂组83.31±8.44＃△－7.37±0.33＃△五味子多糖＋AMPK 抑制剂组68.50±6.82＃△－6.54±0.32＃△

3.3 五味子多糖对T2DM 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）； 与模型组比较，五味子多糖组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低（P＜0.05），AMPK 抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）； 与五味子多糖组比较，AMPK 抑制剂组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比较（μmol/L，±s，n＝10）

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比较（μmol/L，±s，n＝10）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与五味子多糖组比较，△P＜0.05。

组别TNF-αIL-6IL-1β对照组149.93±11.2358.19±5.1042.20±5.79模型组199.60±15.67∗99.38±10.74∗142.49±19.74∗五味子多糖组168.08±12.38＃68.20±6.13＃82.48±14.07＃AMPK 抑制剂组225.06±16.83＃△112.06±12.30＃△171.35±18.24＃△五味子多糖＋AMPK 抑制剂组181.84±12.06＃△86.30±10.34＃△100.38±11.27＃△

3.4 五味子多糖对T2DM 大鼠胰腺组织形态学的影响 正常组大鼠胰腺组织结构完整，胰岛内细胞数量多，细胞排列致密均匀，无明显病变； 与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织受损较严重，胰岛形态不规则，胰岛细胞胞质减少，一些胰岛细胞还在细胞质中表现出液泡变性，炎症细胞浸润明显； AMPK 抑制剂组胰腺组织损伤程度较模型组加重，胰岛细胞空泡变性和炎症细胞增多； 与模型组比较，五味子多糖组大鼠胰腺逐渐恢复，胰岛细胞内细胞质明显增多，空泡变性和炎症细胞浸润减少； 与五味子多糖组比较，五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠胰腺组织损伤加重，较多胰岛细胞空泡变性，炎症细胞浸润增加，见图2。

图2 各组大鼠胰腺组织HE 染色（×200）

3.5 五味子多糖对T2DM 大鼠胰腺组织AMPK、Nrf2、TXNIP 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织Nrf2 蛋白表达、p-AMPK/AMPK 比值降低（P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，五味子多糖组和五味子多糖＋AMPK 抑制剂组大鼠胰腺组织Nrf2 蛋白表达、p-AMPK/AMPK 比值升高 （P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表达降低（P＜0.05），AMPK 抑制剂组大鼠胰腺组织Nrf2 蛋白表达、p-AMPK/AMPK 比值降低（P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表达升高（P＜0.05）； 与五味子多糖组比较，AMPK 抑制剂组和五味子多糖＋AMPK抑制剂组大鼠胰腺Nrf2 蛋白表达、p-AMPK/AMPK 比值降低（P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表达升高（P＜0.05），见表4、图3。

图3 各组大鼠胰腺组织AMPK/Nrf2/TXNIP 通路相关蛋白条带图

表4 各组大鼠胰腺组织AMPK、Nrf2、TXNIP 蛋白表达比较（±s，n＝3）

表4 各组大鼠胰腺组织AMPK、Nrf2、TXNIP 蛋白表达比较（±s，n＝3）

注： 与对照组比较，∗P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与五味子多糖组比较，△P＜0.05。

组别p-AMPK/AMPKNrf2/GAPDHTXNIP/GAPDHNLRP3/GAPDH对照组1.40±0.231.43±0.240.24±0.040.22±0.04模型组0.38±0.07∗0.41±0.08∗0.95±0.18∗0.94±0.16∗五味子多糖组0.94±0.16＃0.96±0.15＃0.36±0.06＃0.40±0.08＃AMPK 抑制剂组0.23±0.06＃△0.25±0.05＃△1.31±0.20＃△1.38±0.22＃△五味子多糖＋AMPK 抑制剂组0.61±0.12＃△0.64±0.11＃△0.59±0.12＃△0.61±0.11＃△

4 讨论

近年来，T2DM 发病率呈现持续升高趋势，具有高致残率和高致死率。T2DM 发病机制复杂，其中胰岛素抵抗是主要病因之一，已知氧化应激、炎症反应等是胰岛素抵抗发生的重要机制。高脂饮食及小剂量注射STZ 是目前常用的构建大鼠T2DM 模型的方法［8］，本研究采用此方法成功构建T2DM 大鼠模型，显示高脂高糖饲料喂养及STZ 可使大鼠产生高血糖、胰腺组织受损、胰岛素抵抗、炎症反应等多种不良影响。

近年来，天然活性物质在T2DM 的治疗中具有积极作用，并得到国内外学者的广泛关注［12-13］。五味子是木兰科植物，其成熟的果实中含有木脂素、挥发油、多糖等活性成分，具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖等作用［14］。多糖是五味子的重要生物活性成分，多项研究表明五味子多糖具有改善血糖的作用，能缓解胰腺组织病变，降低大鼠血糖水平［15］。Jin 等［16］研究显示，五味子多糖可通过AMPK 途径改善大鼠肝细胞中葡萄的糖消耗，并参与预防和缓解胰岛素抵抗。本研究结果显示，五味子多糖治疗的大鼠胰腺组织损伤得到一定缓解，大鼠FBG、P2BG 以及血清胰岛素、炎症因子水平降低，ISI 值升高，提示五味子多糖可改善T2DM 大鼠的血糖水平、胰腺组织损伤、胰岛素抵抗及炎症反应，对于治疗T2DM 具有一定的价值。

AMPK/Nrf2/TXNIP 通路与糖尿病、炎症反应联系密切，AMPK 是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与调控胰岛素抵抗、葡萄糖代谢、脂肪代谢，在T2DM、肥胖等代谢类疾病中低表达［6，17］。多项研究表明，激活AMPK 相关通路在改善T2DM 小鼠胰岛素抵抗［7］、调节糖尿病肝糖原代谢［18］中发挥重要作用。Nrf2 为核转录因子，提高Nrf2 表达可预防T2DM 并发症，并发挥抗炎作用。TXNIP 调控NLRP3 炎症小体和促炎因子，降低TXNIP 表达可抑制NLRP3 激活，从而降低TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎症因子水平，磷酸化的AMPK 可促进Nrf2 激活并抑制TXNIP 表达，对于抑制炎症反应具有积极意义［19-21］。本研究结果显示，T2DM 大鼠胰腺组织p-AMPK/AMPK、Nrf2 蛋白表达较对照组降低，TXNIP、NLRP3 蛋白表达升高，经过五味子多糖治疗后，大鼠胰腺组织 p-AMPK/AMPK、Nrf2 蛋白表达升高，TXNIP、NLRP3 蛋白表达降低； 并且在五味子多糖干预的基础上，使用AMPK 抑制剂可减弱五味子多糖对T2DM 大鼠胰岛素抵抗的改善作用，表明五味子多糖具有一定的激活AMPK/Nrf2 通路，抑制TXNIP、NLRP3 表达的作用。以上结果提示五味子多糖可能通过调控AMPK、Nrf2，抑制TXNIP 发挥抗糖尿病作用。

综上所述，五味子多糖对T2DM 大鼠胰岛素抵抗有一定的缓解作用，可能是通过激活AMPK/Nrf2/TXNIP 通路实现，但相关机制复杂，是否有其他通路间接参与介导，仍需深入研究。