凉粉草浸膏喷雾干燥工艺优化

谢 平，温仁华，魏海峰，沈金海，3，郝春莉，3∗，陈良华

（1.四川大学华西厦门医院科技部，福建 厦门 361022； 2.厦门华厦学院环境与公共健康学院，福建 厦门 361024； 3.厦门市食品药品安全重点实验室，福建 厦门 361024； 4.福建省亚热带植物研究所，福建 厦门 361006）

凉粉草（MesonachinensisBenth.） 又名仙草，为唇形科凉粉草属一年或多年生草本植物［1］，主要成分有黄酮类、酚类、多糖等，具有抗肿瘤、降血压、抗氧化、抗炎等作用［2-3］。

喷雾干燥是一种干燥药材提取液的方法，具有速度快、有效成分破坏少等特点，工艺条件直接影响到浸膏粉的贮存、后续的制粒等流程。由于药材成分较为复杂，影响因素通常不止1 个，需考察的指标较多，因此通过多因素多目标进行优化。在优化过程中需考虑各指标权重，通常通过主观或客观赋权确定指标权重，G1 法是一种主观评价方法与层次分析法相比，计算速度更快、无需一致性检验［4-5］； CRITIC 法是通过实际数据所反映的客观信息确定权重的客观方法［6-7］。通过组合权重可避免数据出现较大偏差，同时减少人为因素的影响； BP 神经网络模拟人脑神经结构，通过反向传播不断调整网络，在不知晓具体数学模型的情况下进行寻优［8-11］。

本实验采用G1 法结合CRITIC 法计算出粉率、含水量、5 种指标成分含量及总黄酮含量的权重系数，以计算所得的综合评分为评价指标，利用BP 人工神经网络模型结合Box-Behnken 响应面法进行优化，验证其可行性，确定最优的喷雾干燥工艺，为凉粉草的应用与开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器 YC-1800 型喷雾干燥机（上海雅程仪器有限公司）； LC-20A 型高效液相色谱仪、UV-2450 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）； DHG-9076A 型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）； JB/T5374-1991 型电子天平［奥豪斯国际贸易（上海） 有限公司］； BSA224S 型电子天平［万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； XS205 型电子天平［十万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； HH-2 型恒温水浴锅（江苏常州华普达有限公司）。

1.2 试剂与药物 凉粉草（产地福建龙岩武平） 购自药材市场，经厦门华厦学院赖源发副教授鉴定为唇形科凉粉草MesonachinensisBenth.的干燥全草。咖啡酸 （批号D18121724，纯度≥98%）、丹酚酸B （批号D18102409，纯度≥98%）、紫草酸 （批号D19041017，纯度≥98%）、紫云英苷（批号D19012403，纯度≥98%） 对照品均由南京狄尔格医药科技有限公司提供； 迷迭香酸 （批号RP180607，纯度≥98%）、芦丁（批号RP190213，纯度≥98%） 对照品均由成都麦德生科技有限公司提供。甲醇、乙腈均为色谱纯； 其他试剂均为分析纯； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 浓缩液制备 根据课题组前期优化的工艺进行提取，将水提液在70 ℃下分别减压浓缩至相对密度1.04～1.08 的浸膏。

2.2 指标成分含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 取咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、紫云英苷、丹酚酸B 对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为0.102 0、0.237 0、0.098 0、0.220 0、0.106 0 mg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取浸膏粉0.1 g，置于25 mL 量瓶中，20% 甲醇溶解，室温下稀释至刻度，过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 以20%甲醇为阴性样品，制成相应溶液，即得。

2.2.4 色谱条件 中谱红RD-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 体积流量1.0 mL/min； 流动相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～9.5 min，18% A； 9.5 ～18.5 min，18% ～19%A； 18.5～20 min，19% ～20%A； 20～25 min，20% ～22% A； 25 ～35 min，22% ～24% A； 35 ～42 min，24% ～30% A； 42 ～50 min，30% ～18% A）； 柱温25 ℃； 检测波长320 nm； 进样量10 μL。咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 色谱峰分离度良好（均大于1.5）； 理论塔板数按咖啡酸计，不低于3 000。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液10 μL，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，发现阴性样品在出峰位置无干扰，表明该方法专属性良好，见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液0.2、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，稀释至刻度，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.2.7 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定6 次，测得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面积RSD 分别为0.83%、0.17%、0.22%、0.26%、0.32%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取供试品溶液适量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，测得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面积RSD 分别为0.86%、2.74%、1.55%、2.67%、2.57%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 精密称取浸膏1 g，按“2.2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，测得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面积RSD 分别为1.50%、1.66%、1.65%、2.59%、1.76%，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取浸膏约0.05 g，精密称定，精密加入对照品溶液适量，按“2.2.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2.4” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 平均加样回收率分别为100.19%、101.18%、100.35%、99.71%、100.08%，RSD 分别为1.62%、1.76%、1.39%、2.78%、2.13%。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品适量，甲醇溶解，即得（该成分质量浓度为0.245 0 mg/mL）。

2.3.2 供试品溶液制备 同“2.2.2” 项。

2.3.3 阴性样品溶液制备 同“2.2.3” 项。

2.3.4 显色方法、检测波长选择 分别精密吸取对照品、供试品溶液各1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，依次加入1.0 mL 7.5%NaNO2溶液后放置6 min，1.0 mL 7.5%Al （NO3）3溶液后放置6 min，10.0 mL 4%NaOH 溶液后放置10 min，摇匀，检测波长200 ～800 nm，空白为缺供试品的显色体系。结果，两者均在500 nm 波长处有最大吸收峰，故选择500 nm 作为检测波长。

2.3.5 标准曲线绘制 精密吸取对照品溶液适量，逐级稀释，按“2.3.4” 项下方法测定吸光度。以对照品吸光度（A） 对其质量浓度（X） 进行回归，得方程为A＝1.01×10－2X＋1.1×10－3（r＝0.999 6），在39.22 ～88.24 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度试验 精密吸取“2.3.1” 项下对照品溶液3.0 mL，按“2.3.4” 项下方法测定吸光度6 次，测得其RSD 为0.41%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液适量，于0、5、10、15、20、25、30 min 按“2.3.4” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为2.55%，表明溶液在30 min 内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 精密称取浸膏0.1 g，共6 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，按“2.3.4” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.28%，表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取6 份芦丁含量已知的浸膏，每份约0.05 g，精密称定，精密加入对照品适量，按“2.3.4” 项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，芦丁平均加样回收率为99.28% （RSD＝2.95%）。

2.4 相对密度测定 按2015 年版《中国药典》 四部通则中“相对密度测定法” 项下第一法（比重瓶法） 进行。

2.5 得粉率测定 取100 mL 凉粉草水煎浓缩液进行喷雾干燥，计算粉末量； 同体积水浴至完全蒸干，在100 ～105 ℃干燥3 h，冷却，精密称定，计算含固量。出粉率＝（粉末量/含固量） ×100%。

2.6 含水量测定 按2015 年版《中国药典》 四部通则中“水分测定法” 项下第二法（烘干法） 进行。

2.7 评价指标的组合赋权

2.7.1 G1 法 根据G1 法，对8 项指标的重要程度排序为含水量＞出粉率＞总黄酮＞咖啡酸＝紫云英苷＝迷迭香酸＝紫草酸＝丹酚酸B （y1＞y2＞y3＞y4＝y5＝y6＝y7＝y8，yk为评价指标），通过rk＝yk－1/yk，k＝n，n－1，…，2 （rk为两者之间的重要性程度之比）［12］，确定各指标的权重评价标度r，r2＝1.2，r3＝1.2，r4＝1.1，r5＝1.0，r6＝1.0，r7＝1.0，r8＝1.0，由公式（Wk－1＝rkwk，k＝n，n－1，…，2） 计算各指标的主观权重wk。

2.7.2 CRITIC 法 对比强度以标准差σj体现，冲突性以指标之间相关性Rj体现，结合两者进行计算，（rij为评价指标i和j之间的相关系数）［13-14］。

将表中的数据进行标准化处理，指标成分＝ （实测值－最小值） /（最大值－最小值），得到相矩阵如下。

表2 各评价指标权重计算结果

2.8 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上，选择进风温度（A）、空气体积流量（B）、泵数（C） 作为影响因素，含水量（y1）、得粉率（y2）、总黄酮（y3）、咖啡酸（y4）、紫云英苷（y5）、迷迭香酸（y6）、紫草酸（y7）、丹酚酸B （y8） 的综合评分（Y） 作为评价指标，进行三因素三水平设计，具体见表3，结果见表4。

表3 Box-Behnken 响应面法因素水平

表4 Box-Behnken 响应面法设计与结果

2.9 回归模型的建立及分析 通过Design Expert 8.0.5b 软件进行拟合，得综合评分（Y） 二次多项回归方程为Y＝0.82－0.021A＋3.700×10－3B＋0.013C＋0.018AB＋8.860 0×10－3AC－0.061BC－0.024A2＋0.018B2＋3.310×10－3C2。再进行方差分析，发现回归模型的P＜0.05，说明它具有显著性； 失拟项（P＝0.665 1） 不显著，说明拟合度良好，可用来分析和预测； 一次项A的P＜0.05，表明其对喷雾干燥工艺影响极显著； 影响凉粉草喷雾干燥工艺的因素依次为进风温度＞泵速＞空气体积流量，见表5。响应面分析见图2。

表5 方差分析结果

2.10 BP 人工神经网络研究

2.10.1 模型建立 本实验建立BP 神经网络模型（3 层），输入节点3 个，即进风温度（A）、空气体积流量（B）、泵数（C）； 输出节点1 个，即综合评分Y。为增加训练空间内的样本密度，根据响应面试验数据，让每组数据增加8个虚拟样本（每组数据增加1 个△±X值，X＝±0.2%），其中17 组作为测试样本，其余作为训练样本。

2.10.2 隐含层节点确定 分别建立隐含层单元数为1～10的模型，并利用其平均绝对误差MAEtrain、平均绝对误差MAEtext、数据整体均方误差MSE 等指标进行分析，最终确定隐层节点数为9，见表6。

表6 神经元数目优化结果

2.10.3 寻优 建立输入层＝3、输出层＝1、隐藏层＝9 的模型，并对其进行训练（循环次数＝1 000，学习速率＝0.01，误差目标＝0.00 001），设置进风温度、空气体积流量、泵数3 个因素的步长为1，并设定每个因素定义域，通过Sim 函数进行仿真输出，寻求输出最大值及对应组合，优化得最佳喷雾干燥工艺为进风温度171 ℃，空气体积流量45 m3/h，泵数12，步距最优值为0.915 1。

2.11 验证试验 利用Design Expert 8.0.5 b 软件得喷雾干燥最佳工艺为进风温度165.47 ℃，空气体积流量45.05 m3/h，泵数11.99%，考虑设备参数设定，将其修正为进风温度165 ℃，空气体积流量45 m3/h，泵数12%。验证试验表明，Box-Behnken 响应面法测得综合评分平均值为0.915 0，BP 人工神经网络测得综合评分平均值为0.915 9，与理论预测值相比无显著性差异，提示工艺稳定可靠，可用于喷雾干燥，见表7。

表7 验证试验结果（n＝3）

3 讨论

本实验通过喷雾干燥方法直接将提取液干燥成粉状，省去滤过、粉碎等工序，简化生产工艺，提高效率。本实验对相对密度、进风温度、泵数与空气体积流量进行单因素实验考察，结果表明当相对密度过大时，出粉率急剧降低、含水量上升，故在后续实验中选择药液相对密度1.06进行考察。由于物料本身极易吸潮，应快速装入密封袋内，立即放入干燥器中密封保存。

与主客观赋权（G1-熵权法、AHP-CRITIC 法等） 相关研究比较，主观赋权G1 法是对主观赋权代表AHP 的一种优化评价方法［15-18］； 本实验中水分是喷雾干燥浸膏的基本性质参数，其数值越低越好，其它评价指标值越高越好，客观赋权CRITIC 法同时考虑了各指标性间的冲突性，因此选择CRITIC 法进行客观赋权。

采用基于G1-CRITIC 法的主客观组合赋权方法，结合Box-Behnken 响应面法回归方程准确度高的优势，确保多指标评价结果的科学性和合理性。与BP 神经网络相关研究比较，采用经G1-CRITIC 法赋权的综合评分，同时利用人工神经网络技术的预测与推断能力，自主学习寻找到大范围内的最优的工艺条件，不增加试验次数，同时获得不同因素的最优组合，节约研究时间与成本，结果更加准确，为其他药材的干燥工艺提供了一种新的思路，有望应用于药材提取、干燥、成型等工艺研究中，具有一定的实际开发利用前景［19］。