臭常山内生真菌次级代谢产物及其α-糖苷酶抑制活性研究

周培凤，卢永仲，汪小杰，李 焱∗，张 振

（1.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州理工学院食品与药品制造工程学院，贵州 贵阳 550003；3.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025； 4.贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550000）

臭常山（OrixajaponicaThunb.） 为芸香科臭常山属落叶灌木植物，全株高约1～3 m，根、茎、叶均有特殊性气味，主要分布于韩国、日本及我国贵州、云南、四川等地［1］。臭常山味苦、辛，性凉，具有疏风清热、行气活血、解毒除湿、截疟、止痛等功效［2］，主要化学成分为喹啉类生物碱和香豆素类化合物。目前尚未出现关于臭常山内生真菌的报道，本研究在前期臭常山化学及活性研究基础上，进一步探索其内生真菌次级代谢产物，对臭常山植物保护及内生真菌开发应用具有重要意义。

1 材料

LRH-500A 型生化培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司）； 核磁共振波谱仪 （400 Hz、600 Hz，美国布鲁克公司）； KT-CJ-1FD 超净工作台（无锡市科泰净化科技有限公司）； SDP-16 半制备液相色谱（日本岛津公司）； Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； 提取分离用乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等均为分析纯，液相色谱所用甲醇、乙腈等试剂均为色谱纯。

臭常山内生真菌分离于贵州省清镇市九龙坡烂泥沟采集的臭常山根中 （海拔1 262 m，东经106°30′7″，北纬26°40′36′′），经形态学及基因序列比对 （Gen Bank accession No.MW376535.1），此菌株被鉴定为Fusariumnematophilum。

2 方法

2.1 菌种发酵 将臭常山根中分离出的内生真菌G- （JK） -2 菌种活化，制备成种子液（种子液配方为麦芽糖20.0 g、谷氨酸钠10.0 g、KH2PO40.50 g、MgSO4·7H2O 0.30 g、葡萄糖10.0 g、酵母膏3 g、甘露醇20 g、去离子水1 L），将制备好的种子液接种于含有大米50 g、去离子水50 mL 的发酵袋中，发酵规模为500 袋，25～29 ℃环境下培养45 d。

2.2 菌株分子鉴定 利用真菌rDNA-ITS 序列通用引物 ITS1 （ 5′-TCCGATGGTGAACCTGCGC-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 进行PCR扩增，利用MEGA.7 软件构建系统进化树。

2.3 产物的提取分离

2.3.1 分离物制备 采用甲醇对菌株Fusarium nematophilum发酵培养物提取3 次，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物40 g。

2.3.2 化合物的分离 乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离，以甲醇-二氯甲烷（0 ∶1 ～1 ∶0） 梯度洗脱，获得7 个亚组分Fr.1～Fr.6。Fr.1 （3.88 g）先以石油醚-乙酸乙酯体系（15 ∶1 ～1 ∶1） 洗脱后，再用二氯甲烷-甲醇体系（5 ∶1 ～0 ∶1） 进行二次硅胶柱层析，得到Fr.1.1 （2.32 g）、Fr.1.2（0.20 g）、Fr.1.3 （0.80 g）。Fr.1.2 经半制备液相色谱纯化，25%乙腈洗脱（体积流量3 mL/min，检测波长254 nm），得化合物G1 （5.0 mg，tR＝11.829 min） 和化合物G2 （2.0 mg，tR＝12.654 min）； Fr.1.3 经pTLC 纯化，以二氯甲烷-甲醇（5 ∶1） 展开，得化合物G3 （350.0 mg）。Fr.2（4.21 g） 底部出现不溶于甲醇的粉末状物质，滤纸过滤使固液分离，粉末状物质用甲醇重复冲洗后得到化合物G4 （8.0 mg）； 滤液浓缩后经半制备液相色谱纯化，20%乙腈洗脱（体积流量3 mL/min，检测波长254 nm），得化合物G5 （10.0 mg，tR＝10.522 min） 和化合物G6 （8.0 mg，tR＝15.312 min）。

Fr.3 （7.28 g） 以石油醚-乙酸乙酯体系（15 ∶1～1 ∶1） 洗脱后再用二氯甲烷-甲醇体系（5 ∶1 ～0 ∶1） 进行二次硅胶柱层析后得到Fr.3.1（0.20 g）、Fr.3.2 （2.0 g）、Fr.3.4 （1.5 g）。Fr.3.2 经pTLC 纯化，以二氯甲烷-甲醇（10 ∶1） 展开，得化合物G7 （736.0 mg） 和化合物G8 （130.0 mg）。

Fr.4 （1.14 g） 经Sephadex LH-20 凝胶柱纯化，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶1） 洗脱，得Fr.4.1（132.8 mg）、Fr.4.2 （79.0 mg）、Fr.4.3 （40.0 mg），Fr.4.1 经半制备液相色谱纯化，以10%甲醇洗脱（体积流量3 mL/min，检测波长254 nm），得化合物G9 （6.8 mg，tR＝6.733 min）。

Fr.5 （1.00 g） 经Sephadex LH-20 凝胶柱纯化，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶1） 洗脱，得Fr.5.1（105.6 mg）、Fr.5.2 （213.4 mg）、Fr.5.3 （565.0 mg）。Fr.5.3 经pTLC 纯化，以二氯甲烷-甲醇（10 ∶1） 展开，得化合物G10 （5.0 mg）。

Fr.6 （1.29 g） 经Sephadex LH-20 凝胶柱纯化，以甲醇洗脱，得Fr.6.1 （200.0 mg）、Fr.6.2（246.6 mg）、Fr.6.3 （186.8 mg）、Fr.6.4 （237.8 mg）。Fr.6.1 经半制备液相色谱纯化，以5%乙腈洗脱（体积流量3 mL/min，检测波长254 nm、210 nm），得化合物G11 （9.0 mg，tR＝7.363 min）、化合物G12 （17.8 mg，tR＝23.43 min）。Fr.6.2经半制备液相纯化，以10%甲醇洗脱（体积流量3 mL/min，检测波长254 nm、210 nm），得化合物G13 （11.0 mg，tR＝10.585 min）。

2.4 α-糖苷酶抑制活性测试 将化合物质量浓度设为1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL，α-糖苷酶浓度为280 U/mL。加入α-糖苷酶及对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 后的反应条件均为37 ℃、15 min。反应结束后于405 nm 波长下检测吸光度。反应体系及加样顺序见表1。

表1 α-糖苷酶抑制活性测试反应体系Tab.1 Reaction system of α-glycosidic enzyme inhibition activity test

表2 部分化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用（±s）Tab.2 Inhibitory effect of some compounds on α-glucosidase enzyme （±s）

表2 部分化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用（±s）Tab.2 Inhibitory effect of some compounds on α-glucosidase enzyme （±s）

注： 不同小写字母代表不同质量浓度之间存在显著差异（P＜0.05）。

质量浓度/（mg·mL－1）抑制率/%G4G10G11G12G13阿卡波糖1 47.90±0.87a36.54±0.36a40.51±0.82a27.22±0.56a27.72±0.17a89.02±0.87a 0.834.03±0.88b26.96±0.21b32.80±0.73b23.67±0.62b24.96±0.59b86.65±0.63ab 0.632.55±0.48bc25.23±0.22c30.54±0.39c16.57±0.44c21.20±0.54c84.86±1.27bc 0.430.71±0.27cd21.57±0.86d26.08±0.64d12.43±0.33cd19.91±0.46c82.39±0.59c 0.230.18±0.78d19.08±0.16e20.10±0.62e9.22±0.03d16.41±0.30d78.27±1.1d 0.126.12±0.11e17.50±0.25f12.82±0.50f4.14±0.48e15.02±0.74d71.30±0.77e

计算α-糖苷酶抑制率，公式为抑制率＝｛［（AA－AB） － （AC－AD） ］ /（AA－AB） ｝ ×100%，其中AA～AD分别为A～D 组吸光度。

3 结果与分析

3.1 菌株鉴定结果 内生真菌G- （JK） -2 rDNA的ITS 经PCR 扩增，产物序列长度563 bp，测序数据GGAGGGGGGATCCTACCTGATCCGAGGTCACA TTCAGAAAAGTTGGGGGGTTTAACGGCTTGGCCGCG CCGCGTTCCAGTTGCGAGGTGTTAGCTACTACGCAA TGGAGGCTGCAGCGAGACCGCCACTAGATTTAGGGG CCGGCGCGTCCTCTGGCGAGGCCGTTGTGCCGATCC CCAACACCAAGCCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGA CGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGG GCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA ATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCG TTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTGATTTATTTATAGTGGTACTCAGAAGAT ACAAATTAAGACAGGGTTTTGGGTCCTCTGGCGGGC CGTCCCGTTTTACGGGGCGCGGTGATCCGCCGAGGC AACAGTATGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGT AAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACG GAGACCTTGTTACGACTTTTACTT。

从菌株形态上看，菌株培养一段时间后菌丝呈白色，棉花状，菌落规则且孢子形态与Fusarium nematophilum基本一致，见图1，推测G- （JK） -2可能为Fusariumnematophilum［3］。从分子学角度上分析，首先将获取的序列在NCBI 中进行BLAST，数据显示前20 条序列均为Fusariumsp.，相似度93% ～97%。利用MEGA 7.0 软件构建进化树，方法为最大似然法（maximum likelihood，ML），执行参数Bootstra 设为1 000 次重复，其余参数设置为默认值，见图 2，结果表明 G- （ JK） -2 为Fusariumnematophilum。

图1 G- （JK） -2 孢子形态Fig.1 Spore morphology of 2 G- （JK） -2

图2 G- （JK） -2 系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of G- （JK） -2

3.2 化合物结构鉴定 化合物G1： 白色粉末，分子式C7H6O2，ESI-MSm/z： 123.1 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz，CD3OD）δ： 9.74 （1H，s，H-7），7.76 （1H，d，J＝8.7 Hz，H-2，6），6.90 （2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，5）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 192.9 （C-7），166.0 （C-4），133.5（C-2，6），129.9 （C-1），117.1 （C-3，5）。以上数据与文献 ［4］ 报道基本一致，故鉴定为phydroxybenzaldehyde。

化合物G2： 白色粉末，分子式C8H8O2，ESIMSm/z： 137.1 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 7.88 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6），6.83 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），2.52 （3H，s，H-8）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 199.5（C-7），164.3 （C-4），132.1 （C-3，5），130.0（C-1），116.3 （C-3，5），26.3 （C-8）。以上数据与文献 ［5］ 报道基本一致，故鉴定为 4-hydroxyacetophenone。

化合物G3： 黄色油状，分子式C6H8O2，ESIMSm/z： 113.1 ［M ＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ： 5.82 （1H，m，H-6），4.39 （2H，t，J＝6.3 Hz，H-3），2.39 （2H，m，H-4），2.01（3H，m，H-7）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：164.7 （C-1），158.0 （C-5），116.7 （C-6），65.9（C-3），29.2 （C-4），23.1 （C-7）。以上数据与文献［6］ 报道一致，故鉴定为anhydromevalonolactone。

化合物G4： 黄色粉末，分子式C17H12N2O4，ESI-MSm/z： 307.1 ［M-H］－。1H NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ： 11.61 （1H，s，H-9），8.85 （1H，s，H-4），8.42 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-5），7.82（1H，d，J＝8.3 Hz，H-8），7.65 （1H，t，J＝7.7 Hz，H-7），7.42 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-3′），7.35 （1H，t，J＝7.5 Hz，H-6），6.63 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-4′），4.68 （2H，s，H-6′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ： 166.6 （C-10），157.3（C-5′），150.3 （C-2′），141.4 （C-8a），132.5（C-9a），131.9 （C-1），129.9 （C-4a），129.0（C-7），122.1 （C-5），121.0 （C-5a），120.6 （C-6），115.8 （C-4），112.9 （C-8），111.1 （C-3′），109.3 （C-4′），56.0 （C-6′）。以上数据与文献［7］ 报道基本一致，故鉴定为flazine。

化合物G5： 无色针晶，分子式C7H6O3，ESIMSm/z： 139.3 ［M ＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ7.79 （1H，dd，J＝7.9，1.8 Hz，H-6），7.51 （1H，t，J＝8.0 Hz，H-4），6.93 （2H，m，H-3，5）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ：171.9 （ C-7），161.1 （ C-2），135.7 （ C-4），130.3 （ C-6），119.2 （ C-5），117.1 （ C-3），112.9 （C-1）。以上数据与文献［8］ 报道基本一致，故鉴定为salicylic acid。

化合物G6： 无色针晶，分子式C7H6O3，ESIMSm/z： 137.1 ［M-H］－，1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ： 12.41 （1H，s，OH），10.21 （1H，s，OH），7.79 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），6.82 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ： 167.2 （C-7），161.6（C-4），131.5 （C-2，6），121.4 （C-1），115.1（C-3，5）。以上数据与文献［9］ 报道基本一致，故鉴定为p-hydroxybenzoic acid。

化合物G7： 无色油状，分子式C24H38O4，HR-ESI-MSm/z： 413.265 77 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ： 7.71 （1H，dd，J＝5.7，3.3 Hz，H-2），7.54 （2H，dd，J＝5.7，3.3 Hz，H-3），4.21 （2H，m，H-6），1.68 （1H，m，H-7），1.36 （8H，m，H-8，9，10，12），0.91（6H，m，H-11，13）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ： 167.9 （C-4），132.5 （C-1），131.0 （C-3），128.9 （C-2），68.3 （C-6），38.9 （C-7），30.5（C-8），29.1 （C-9），23.9 （C-12），23.1 （C-10），14.2 （C-11），11.1 （C-13）。以上数据与文献［10］ 报道基本一致，故鉴定为 di- （2-ethylhexyl） -phthalate。

化合物G8： 黄色油状，分子式C24H38O4，HR-ESI-MSm/z： 413.266 2 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ： 8.10 （s，4H，H-2，2′，H-3，3′），4.25 （m，2H，H-6），1.73 （m，1H，H-7），1.39 （ m，8H，H-8，9，10，12），0.92（6H，m，H-11，13）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ： 166.1 （C-4），134.4 （C-1），129.6 （C-2），67.9 （C-6），39.0 （C-7），30.7 （C-8），29.1（C-9），24.1 （C-10），23.1 （C-11），14.2 （C-12），11.2 （C-13）。以上数据与文献［11］ 报道一致，故鉴定为 terephthalic acid bis （2-ethylhexyl） ester。

化合物G9： 白色粉末，分子式C5H6N2O2，ESI-MSm/z： 127.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 10.99 （1H，s，H-3），10.57 （1H，s，H-1），7.24 （1H，d，J＝5.6 Hz，H-6），1.73（3H，s，H-7）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ：164.9 （ C-4），150.5 （ C-2），137.7 （ C-6），107.7 （C-5），11.8 （C-7）。以上数据与文献［12］ 报道基本一致，故鉴定为thymine。

化合物G10： 白色无定形粉末，C9H13N2O6，ESI-MSm/z： 244.2 ［M-H］－。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 11.32 （1H，s，NH），7.89 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-6），5.78 （1H，d，J＝5.5 Hz，H-1′），5.65 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-5），5.39（1H，brs，OH），5.10 （1H，brs，OH），4.02 （H，t，J＝5.3 Hz，1H-2′），3.96 （1H，m，H-3′），3.84 （1H，q，J＝3.4 Hz，H-4′），3.62 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-5′a），3.55 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-5′b）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 163.3 （C-4），150.9 （C-2），140.9 （C-6），100.9 （C-5），87.8 （C-1′），84.9 （C-4′），73.6 （C-2′），70.0（C-2′），60.9 （C-3′）。以上数据与文献［13］ 基本一致，故鉴定为uridine。

化合物G11： 白色固体，分子式C10H13N5O4，ESI-MSm/z： 268.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 8.36 （1H，s，H-2），8.14 （1H，s，H-8），7.35 （2H，s，NH2），5.89 （1H，d，J＝6.2 Hz，H-1′），5.50 （1H，brs，2′-OH），5.44（1H，brs，5′-OH），5.26 （1H，brs，3′-OH），4.62 （1H，t，J＝5.6 Hz，H-2′），4.15 （1H，m，H-3′），3.97 （1H，q，J＝3.4 Hz，H-4′），3.67（1H，brs，H-5′a），3.57 （1H，brs，H-5′b）；13CNMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 156.1 （C-6），152.4 （ C-2），149.0 （ C-4），139.9 （ C-8），119.3 （C-5），87.9 （C-1′），85.9 （C-4′），73.5（C-2′），70.6 （C-3′），61.7 （C-5′）。以上数据与文献［14］ 报道基本一致，故鉴定为adenosine。

化合物G12： 黄色粉末，分子式C9H12N2O5，HR-ESI-MSm/z： 227.067 345 ［M-H］－。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ： 11.30 （1H，s，NH），7.86 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-6），6.15 （1H，t，J＝6.8 Hz，H-1′），5.64 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-5），5.26 （1H，brs，OH），5.03 （ 1H，brs，1OH），4.23 （1H，m，H-3′），3.78 （1H，m，H-4′），3.55 （2H，m，H-5′），2.10 （2H，m，H-2′）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ： 163.2（C-4），150.5 （C-2），140.5 （C-6），100.8 （C-5），87.4 （C-4′），84.1 （C-1′），70.4 （C-3′），61.3 （C-5′），39.7 （C-2′）。以上数据与文献［15］ 报道一致，故鉴定为2′-deoxyuridine。

化合物G13： 白色无定形粉末，分子式C6H5NO2，HR-ESI-MSm/z： 122.024 45 ［M-H］－。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ： 9.08 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-2），8.80 （1H，dd，J＝4.9，1.7 Hz，H-6），8.29 （1H，dt，J＝7.9，1.9 Hz，H-4），7.56 （1H，dd，J＝7.6，4.5 Hz，H-5）；13CNMR （100 MHz，DMSO-d6）δ： 166.2 （-COO-），153.2 （ C-6），150.1 （ C-2），137.1 （ C-4），126.6 （C-3），123.9 （C-5）。以上数据与文献［16］ 报道基本一致，故鉴定为nicotinic acid。

3.3 α-糖苷酶抑制活性测试 在测试质量浓度范围内（0.1～1.0 mg/mL），α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着样品质量浓度增加而增强。质量浓度为1 mg/mL 时G4 的抑制活性最强，抑制率可达到（47.90±0.87）%，在测试质量浓度范围内各化合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用依次为G4＞G11＞G10＞G13＞G12。

4 讨论

本研究对臭常山根中的内生真菌G- （JK） -2进行了鉴定，确定其为镰刀属内生真菌Fusarium nematophilum，对其次级代谢产物研究分离得到了13 个化合物，化合物类型包括酚酸类、生物碱类、酯类。所有化合物均首次从臭常山内生真菌Fusariumnematophilum中分离得到，其中G7、G8、G10、G11、G13 首次从镰刀属内生真菌中分离得到。α-糖苷酶抑制活性筛选结果表明，化合物G4和G11 在1 mg/mL 的质量浓度下二者抑制率分别为（47.90±0.87）% 和（40.51±0.82）%。本研究丰富了Fusariumsp.的化学成分数据库，为臭常山内生真菌次级代谢产物的研究提供了参考。