金雀异黄素通过调控TGF-β1/Smad3 信号通路对2 型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响

2024-03-12姜欣，王智，王娟

中成药 2024年2期

姜欣，王智，王娟

（1.北华大学附属医院心血管科，吉林吉林 132001； 2.吉林市中心医院妇科，吉林吉林 132001）

糖尿病心肌病是导致糖尿病患者心源性休克、心力衰竭甚至死亡的主要因素，是糖尿病最常见的并发症之一［1-2］。糖尿病心肌病发病因素众多，机制复杂，目前并没有阐明确切的机制，但心肌纤维化在糖尿病心肌病发病进程中起着关键作用，同时也是引起糖尿病患者心功能降低的主要因素［3］。抑制心肌纤维化对于防治糖尿病心肌病具有深远意义。

金雀异黄素是大豆异黄酮类化合物，又称染料木黄酮或染料木素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、治疗骨质疏松及提高免疫力等多种作用［4-5］。文献报道金雀异黄素可以通过降低Aβ 蛋白沉积和Tau 蛋白的磷酸化水平，增加神经生长因子和营养因子表达，改善糖尿病小鼠记忆功能障碍［6］；可以提高肾皮质基质金属蛋白酶-2/基质金属蛋白酶抑制剂-1 比值，降低非肌肉型肌球蛋白重链表达，延缓糖尿病肾病进展［7］；可逆转糖尿病的氧化应激和炎症，缓解血管功能障碍［8］。但目前为止，金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的抑制作用及机制研究鲜有报道。

本实验通过建立大鼠2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）模型，旨在探讨金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响，并阐明潜在的作用机制，从而为糖尿病心肌病的防治提供参考依据。

1 材料

1.1 动物及饲料雄性SD 大鼠60 只，SPF 级，体质量180～220 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司［实验动物生产许可证号SCXK（吉） 2020-0002］，饲养于吉林医药学院动物实验中心［实验动物使用许可证号SYXK （吉） 2022-0003］，分笼饲养（5 只/笼），明暗各12 h，相对湿度50% ～60%，室温23～25 ℃。本研究经北华大学动物伦理委员会批准（伦理号2021021601），符合动物伦理相关规定。高脂饲料由基础饲料、胆酸钠、蛋黄粉、猪油及胆固醇构成，各成分比例分别为83.5%、0.5%、5%、10% 及1%，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。

1.2 药物与试剂金雀异黄素（货号YYI-023，含量98%）购自陕西永源生物技术有限公司；二甲双胍（国药准字H20023370，规格0.5 g/片）购自中美上海施贵宝制药有限公司。链脲菌素（streptozotocin，STZ，货号18883-66-4）购自美国Merck 公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB，货号H197-1-2）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST，货号C010-2-1）及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH，货号A020-2-2）酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所； Masson 染色试剂盒（货号R21866-7）购自上海尚宝生物科技有限公司； TRIzol （货号15596026）、逆转录试剂盒（货号K1691）及qPCR 试剂盒（货号A44360）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司； Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ，货号ab21286）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ，货号ab7778）、转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1，货号ab92486）及Smad同源物3 （smad homolog 3，Smad3，货号ab84177）多克隆抗体均购自美国Abcam 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，货号TA-08）及IgG 二抗（货号10494-1-AP）均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；DAB 显色试剂盒（货号DA10155）、增强型化学发光试剂盒（enhanced chemiluminescence，ECL，货号SW20305）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器 ZA600R3 型分析天平（上海赞维衡器有限公司）； OneTouch Ⅱ型血糖仪（美国Johnson＆ Johnson 公司）； Vevo 3100LT 型小动物超声仪（美国 FUJIFILM Visualsonics 公司）； SuPerMax 3100 型酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；RM2245 型切片机（德国Leica 公司）； 4XC20BD型光学显微镜（上海光学仪器厂）； 7500 型qPCR仪（美国ABI 公司）； DYCZMINI4 型电泳设备、DYCZ-TRANS2 型转印设备（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分组与给药参照高振华等［9］的方法建立T2DM 大鼠模型。将SD 大鼠饲养1 周后，按照体质量随机分为正常组（10 只）及高脂组（50 只），正常组大鼠给予基础饲料喂养，高脂组大鼠给予高脂饲料喂养。4 周后，各组大鼠均禁食12 h，高脂组大鼠腹腔注射35 mg/kg STZ 溶液（用pH 4.5 的柠檬酸钠缓冲液溶解），正常组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲液。1 周后，测量空腹血糖值，空腹血糖值≥16.7 mmo/L 认为模型建立成功。共有42 只大鼠符合成模标准，将空腹血糖值最高和最低的大鼠各1 只排除，剩余40 只。成模大鼠随机分为模型组、二甲双胍组（100 mg/kg）及金雀异黄素低、高剂量组（50、100 mg/kg），每组10 只，其中金雀异黄素给药剂量参考杨琪等［10］的研究并结合预实验结果而设定，二甲双胍给药剂量参考林心君等［11］的研究。给药组每天灌胃给药1 次，连续8 周；正常组及模型组大鼠灌胃溶媒（0.5% 羧甲基纤维素钠），灌胃体积均为10 mL/kg。

2.2 体质量、心功能、心脏质量及心脏指数等指标检测末次灌胃给药24 h 后，称定大鼠体质量。利用动物超声仪检测每搏输出量（stroke volume，SV）、射血分数（ejection fraction，EF）、左心室收缩末期内径（left ventricular internal diameter endsystole，LVIDs）及左心室舒张末期内径（left ventricular internal diameter end-diastole，LVIDd）等心功能指标。用戊巴比妥钠麻醉大鼠，通过腹主动脉取血，离心分离血清。迅速剖取心脏，反复清洗至无血液，擦干水分后称定心脏质量，用心脏质量与体质量之比计算心脏指数。血清及心脏均保存于超低温（－80 ℃）冰箱。

2.3 血清CK-MB、AST 及LDH 活性检测采用ELISA 法检测血清CK-MB、AST 及LDH 活性，相关操作步骤严格按照大鼠CK-MB、AST 及LDH 活性检测试剂盒的说明书进行。

2.4 心肌纤维化程度观察心肌组织经常规固定、脱水、包埋及切片等步骤，根据Masson 染色试剂盒的操作指南进行处理。于光学显微镜下观察，其中呈蓝色的为胶原纤维，肌纤维呈红色，并通过Image-Pro Plus 6.0 软件分析心肌组织胶原相对面积。

2.5 心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白分布及表达检测心肌组织经常规固定、脱水、包埋及切片等步骤，于枸橼酸缓冲液中进行微波修复。在室温下用3% H2O2孵育30 min，再用5%山羊血清封闭30 min，分别加入稀释至合适比例的CollagenⅠ（1 ∶ 5 000）和Collagen Ⅲ（1 ∶5 000）多克隆抗体，在4 ℃环境下孵育过夜。再加入二抗（1 ∶5 000），在37 ℃环境下孵育30 min；滴加ABC 工作液，在37 ℃环境下继续孵育60 min。DAB 显色后再用苏木素复染，二甲苯透明后，进行脱水处理，封片。通过Image-Pro Plus 6.0 软件分析积分吸光度。

2.6 心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA 表达检测心肌组织总RNA 采用TRIzol 试剂提取，随后进行逆转录反应，获得cDNA 模板。按照试剂盒说明书操作，行PCR 扩增反应，所需引物由吉林省库美生物科技有限公司合成，引物序列见表1。通过2－ΔΔCT方法计算TGF-β1 及Smad3 mRNA 的相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 心肌组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达检测将组织裂解液预冷，每100 mg 心肌组织加入1 mL 组织裂解液，放入超声破碎仪中，匀浆后离心收集上清，用二喹啉甲酸法测定蛋白含量。制备的上清液与5×上样缓冲液混合后，于水浴锅中煮沸10 min使蛋白变性。取10 μg 蛋白上样，行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转蛋白至聚偏二氟乙烯膜，用5% 脱脂奶粉溶液在室温下封闭1 h。洗膜后，加入稀释至合适比例的TGF-β1（1 ∶1 000）、Smad3 （1 ∶1 000）及GAPDH （1 ∶2 500）多克隆抗体，在4 ℃下孵育过夜。洗膜后，再加入二抗（1 ∶5 000），在室温下孵育30 min。再次洗膜，滴加ECL 液显色，曝光后拍照，通过Image J 1.8 软件分析目的蛋白TGF-β1 及Smad3 相对表达量。

2.8 统计学分析通过SPSS 22.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 金雀异黄素对糖尿病大鼠体质量、心脏质量及心脏指数的影响正常组大鼠反应灵敏，毛发光泽，饮水、饮食及尿量均正常；模型组大鼠活动减少，毛发干枯发黄，饮水、饮食及尿量均增多；各给药组大鼠上述糖尿病症状均有不同程度的缓解。如表2 所示，给药8 周后，与正常组比较，模型组大鼠体质量降低（P＜0.01），心脏质量无明显变化（P＞0.05），心脏指数增加（P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素各剂量组及二甲双胍组大鼠体质量增加（P＜0.01），心脏质量无明显变化（P＞0.05），心脏指数降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 金雀异黄素对糖尿病大鼠体质量、心脏质量及心脏指数的影响（±s，n＝10）Tab.2 Effects of genistein on weight of the body and heart，and cardiac indices levels in diabetic rats （±s，n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1）体质量/g心脏质量/g心脏指数/%正常组—682.86±49.351.65±0.200.241±0.031模型组—399.32±50.46∗∗1.54±0.130.386±0.045∗∗金雀异黄素低剂量组50438.56±63.71＃＃1.50±0.090.342±0.039＃金雀异黄素高剂量组100552.94±45.54＃＃1.52±0.120.275±0.024＃＃二甲双胍组100564.30±58.28＃＃1.57±0.160.278±0.033＃＃

3.2 金雀异黄素对糖尿病大鼠心功能的影响如表3 所示，与正常组比较，模型组大鼠SV、EF 降低（P＜0.01），LVIDs、LVIDd 升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素高剂量组及二甲双胍组大鼠SV、EF 升高（P＜0.01），LVIDs、LVIDd 降低（P＜0.05，P＜0.01），金雀异黄素低剂量组大鼠SV、EF 升高（P＜0.01），LVIDs 降低（P＜0.05），LVIDd 无明显变化（P＞0.05）。

表3 金雀异黄素对糖尿病大鼠心功能的影响（±s，n＝10）Tab.3 Effects of genistein on cardiac function of diabetic rats （±s，n＝10）

注：与正常组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1）SV/μLEF/%LVIDs/mmLVIDd/mm正常组—185.10±19.2472.68±8.433.81±0.436.82±0.64模型组—83.61±11.76∗∗45.53±5.27∗∗5.92±0.51∗∗7.56±0.82∗金雀异黄素低剂量组50101.33±9.80＃＃52.85±5.66＃＃5.28±0.65＃7.24±0.67金雀异黄素高剂量组100125.79±10.47＃＃59.76±7.19＃＃4.73±0.38＃＃6.70±0.73＃二甲双胍组100109.32±12.51＃＃61.09±6.38＃＃5.12±0.54＃＃6.75±0.59＃

3.3 金雀异黄素对糖尿病大鼠血清CK-MB、AST及LDH 活性的影响如表4 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性均升高（P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素各剂量组及二甲双胍组大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 金雀异黄素对糖尿病大鼠血清CK-MB、AST 及LDH 活性的影响（±s，n＝10）Tab.4 Effects of genistein on serum levels of CK-MB，AST and LDH activities in diabetic rats （±s，n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1）CK-MB/（U·L－1）AST/（U·L－1）LDH/（U·L－1）正常组—619.84±72.4393.48±7.2635.60±4.07模型组—846.65±97.54∗∗169.56±18.67∗∗59.78±6.32∗∗金雀异黄素低剂量组50764.03±68.91＃142.64±12.80＃42.54±5.86＃＃金雀异黄素高剂量组100720.47±83.66＃＃131.22±15.14＃＃33.19±4.36＃＃二甲双胍组100651.71±51.34＃＃117.09±10.38＃＃35.20±3.15＃＃

3.4 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响如图1 所示，正常组大鼠心肌细胞整齐排列，形态正常，心肌间质几乎无胶原纤维分布；模型组大鼠心肌细胞紊乱排列，心肌细胞肥大，部分细胞溶解、肿胀、变形，心肌间质可见胶原纤维大量沉积；金雀异黄素各剂量组及二甲双胍组大鼠心肌细胞排列紊乱的现象有不同程度的改善，结构形态较正常，心肌间质胶原纤维沉积情况有所缓解，尤其是金雀异黄素高剂量组及二甲双胍组更为明显。通过图像分析系统进一步分析心肌组织胶原相对面积，结果见表5，与正常组比较，模型组大鼠心肌组织胶原相对面积增加（P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素各剂量组及二甲双胍组大鼠心肌组织胶原相对面积减少（P＜0.01）。

图1 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响（Masson，×200）Fig.1 Effects of genistein on myocardial fibrosis in diabetic rats （Masson，×200）

表5 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织胶原相对面积的影响（±s，n＝6）Tab.5 Effects of genistein on relative collagen deposition area in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝6）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1）胶原相对面积/%正常组—2.20±0.37模型组—9.45±1.24∗∗金雀异黄素低剂量组505.86±0.89＃＃金雀异黄素高剂量组1003.21±0.55＃＃二甲双胍组1003.67±0.61＃＃

3.5 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表达的影响如图2、表6 所示，正常组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白均呈弱阳性表达，在心肌组织中微量存在；与正常组比较，模型组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达均升高（P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素各剂量组及二甲双胍组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表达的影响（免疫组化，×200）Fig.2 Effects of genistein on protein expressions of Collagen Ⅰand Collagen Ⅲin myocardial tissue of diabetic rats （IHC，×200）

表6 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白积分吸光度的影响（±s，n＝6）Tab.6 Effects of genistein on integrated absorbance of Collagen Ⅰand Collagen Ⅲin myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝6）

注：与正常组比较，∗∗P ＜0.01；与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1） Collagen ⅠCollagen Ⅲ正常组—0.08±0.010.10±0.01模型组—0.21±0.03∗∗ 0.33±0.04∗∗金雀异黄素低剂量组500.17±0.02＃ 0.15±0.02＃＃金雀异黄素高剂量组1000.11±0.01＃＃ 0.13±0.01＃＃二甲双胍组1000.09±0.01＃＃ 0.12±0.02＃＃

3.6 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA 表达的影响如表7 所示，与正常组比较，模型组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素各剂量组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA 表达降低（P＜0.01）。

表7 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA 表达的影响（±s，n＝3）Tab.7 Effects of genistein on mRNA expressions of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝3）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1）TGF-β1/GAPDHSmad3/GAPDH正常组—1.02±0.041.05±0.06模型组—2.73±0.32∗∗2.29±0.20∗∗金雀异黄素低剂量组501.68±0.21＃＃1.51±0.18＃＃金雀异黄素高剂量组1001.26±0.17＃＃1.42±0.23＃＃二甲双胍组1001.54±0.26＃＃1.27±0.14＃＃

3.7 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达的影响如图3、表8 所示，与正常组比较，模型组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3蛋白表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，金雀异黄素各剂量组及二甲双胍组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 蛋白条带图Fig.3 Protein bands of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of rats in each group

表8 金雀异黄素对糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Tab.8 Effects of genistein on protein expressions of TGF-β1 and Smad3 in myocardial tissue of diabetic rats （±s，n＝3）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg－1）TGF-β1/GAPDHSmad3/GAPDH正常组—0.33±0.050.19±0.03模型组—0.95±0.11∗∗0.87±0.08∗∗金雀异黄素低剂量组500.71±0.09＃0.62±0.04＃＃金雀异黄素高剂量组1000.46±0.05＃＃0.37±0.04＃＃二甲双胍组1000.53±0.06＃＃0.48±0.05＃＃

4 讨论

本研究给予T2DM 模型大鼠金雀异黄素8 周后发现，金雀异黄素可以增加大鼠体质量，减少心脏指数，升高SV、EF，降低LVIDs、LVIDd，同时还可降低血清CK-MB、AST 及LDH 活性，证实了金雀异黄素可以缓解心脏损伤，具有保护心脏功能的作用。

心肌纤维化是糖尿病性心肌病最典型的病理变化，其主要由胶原纤维含量升高、过量沉积或胶原成分发生变化所引起［12］。成纤维细胞是细胞外基质产生的重要来源，在心肌纤维化中起到关键作用，是心肌间质纤维化的重要效应细胞［13］。心肌成纤维细胞合成与分泌胶原纤维的主要类型为Collagen I、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ和Collagen V，其中Collagen I 占80%，Collagen Ⅲ占11%。王振贤等［14］研究发现，白芍总苷可改善糖尿病大心肌组织鼠病理变化，降低心肌组织Collagen I、Collagen Ⅲ表达，抑制心肌纤维化。本研究同样发现，金雀异黄素可以降低心肌组织胶原相对面积及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达，具有减轻糖尿病大鼠心肌纤维化作用。

TGF-β1/Smad3 信号通路在心肌纤维化与合成心肌胶原过程中起着举足轻重的作用，目前已成为心肌纤维化研究领域的焦点［15］。TGF-β1 可通过激活下游Smad3 等经典的Smads 途径，活化心肌成纤维细胞，促进Collagen I 及Collagen Ⅲ的大量分泌，引起心肌纤维化，影响心脏功能［16］。阻断TGF-β1/Smad3 信号通路能够有效抑制心肌成纤维细胞的增殖与分化，减少Collagen I 及Collagen Ⅲ的合成，从而缓解心肌纤维化症状［17］。竹节参总皂苷能够使心肌组织中TGF-β1、Smad3 蛋白表达降低，通过调节TGF-β1/Smad3 信号通路改善衰老大鼠心肌纤维化程度［18］。本研究发现，金雀异黄素可以降低TGF-β1、Smad3 mRNA 及蛋白表达，具有抑制TGF-β1/Smad3 信号通路的作用，该作用可能是其减轻糖尿病大鼠心肌纤维化，进而发挥保护心脏效应的潜在机制。金雀异黄素对TGF-β1/Smad3 信号通路的影响已在多项研究中被证实。研究发现，金雀异黄素可以通过降低TGF-β1、Smad3 等蛋白的表达，起到抗糖尿病大鼠肾脏纤维化作用［19］。金雀异黄素也可以通过TGF-β1/Smad3依赖性信号通路缓解双肾单切高血压大鼠血管功能障碍和肾脏损伤［20］。

综上所述，金雀异黄素可以通过抑制TGFβ1/Smad3 信号通路，减轻糖尿病大鼠心肌纤维化，进而发挥保护心脏效应。本研究的相关工作可为糖尿病心肌病提供新的防治靶点，也可为金雀异黄素用于糖尿病心肌病的防治提供一定的实验依据。