防风气味与化学成分相关性研究

魏丽红，常福瑞，闫 爽，郝德国，于东辉，王冬梅，刘晓秋，潘英妮

（沈阳药科大学中药学院，沈阳市中药药效物质研究与创新药开发重点实验室，辽宁 沈阳 110016）

防风来源于伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata（Turcz.） Schischk.的干燥根，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉等功效，现代临床多用于治疗感冒、头痛、风湿痹痛等［1］。气味是中药材质量评价的重要指标，中药传统性状鉴别多以人的感官鉴别为主，具有一定的主观性和经验性，鉴别结果的准确性和重现性较差。电子鼻技术实现了特征性气味的检测，电子鼻也称人工嗅觉系统，是模拟动物嗅觉器官开发出的高科技产品，其主要工作机制是阵列中的每个传感器对不同被测气体的灵敏度不同，不同气体在不同传感器上产生的响应高低不同，最终形成传感器阵列对不同气体的响应图谱［2］。目前，电子鼻技术已经广泛应用于食品、农业、环境控制、鉴别中药材的真伪、产地等［3-8］。与2020 年版《中国药典》 中防风性状描述一致的是野生防风，由于防风临床疗效良好，需求量大，导致野生防风资源匮乏。目前市场上流通的主要是栽培品，也常见野生防风中混有抽薹防风，而药典规定抽薹防风不可药用，临床对栽培防风的认可度也不高［9］。传统中医理论认为，药物形态、颜色、气味、质地与药性相关，性状是决定药性的主要因素［10］。本实验从气味出发，借助电子鼻对不同防风粉末的整体气味进行客观化表达，探究不同生长方式防风的气味与化学成分间的相关性及栽培防风、抽薹防风与野生防风的区别。

1 材料

1.1 仪器 PEN 型电子鼻（北京盈盛恒泰科技有限公司）； FW100 型粉碎机、DK-98-1 型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）； LC-20AB 型高效液相色谱仪，配置SPD-20AUV 型检测器、LC-Solution 型色谱工作站（日本岛津公司）； TGL-16B 型高速离心机 （上海安亭科学仪器厂）； 2600-UV/VIS 型紫外分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］。

1.2 试剂 升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷对照品（纯度≥98%，成都普菲德生物有限公司）。95%硫酸、蒽酮（天津市大茂化学试剂厂）。甲醇、甲酸为色谱纯（天津市康科德科技有限公司）； 乙酸乙酯为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 药材 防风共15 批，经沈阳药科大学潘英妮教授鉴定为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根，具体见表1。

表1 样品信息

2 挥发油含量测定

按照2020 年版《中国药典》 四部2204 项下方法操作，分别取栽培防风、野生防风、抽薹防风各50 g，粉碎，过60 目筛备用。将粉碎好的药材置圆底烧瓶中，加10 倍量纯净水和一定量的沸石，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使其充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止，圆底烧瓶置于电热套加热至沸腾并保持微沸至测定器中油量不再增加（约5 h），停止加热，放置片刻，开启测定器的下端活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达零刻度线上方5 mm 处为止，放置1 h以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与零刻度线平齐，读取挥发油量，并计算挥发油含量。

3 多糖含量测定

3.1 对照品溶液制备 取无水葡萄糖对照品25 mg，精密称定，置于25 mL 量瓶中，蒸馏水定容至刻度，即得含1.084 mg/mL 葡萄糖的贮备溶液。取2.5 mL 至25 mL 量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，配制成质量浓度为0.108 4 mg/mL 的对照品溶液。

3.2 供试品溶液制备 精密称取野生防风、栽培防风、抽薹防风粉末各0.5 g，置于50 mL 圆底烧瓶中，加入25 mL 95%乙醇回流提取2 次，每次1 h，过滤，弃去滤液，回收滤渣，滤渣挥干溶剂后加25 mL 蒸馏水回流2 次，每次1 h，合并2 次提取液，转移至100 mL 量瓶中，加水定容至刻度，取1 mL，置于50 mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

3.3 蒽酮-浓硫酸试剂制备 精密称取蒽酮粉末0.22 g，置于100 mL 棕色量瓶中，加80%浓硫酸溶解，定容至刻度，即得。

3.4 最大吸收波长的确定 吸取对照品、供试品溶液各1 mL，置于具塞试管中，冰水浴下分别缓慢加入0.2%的蒽酮-浓硫酸试剂4 mL，混匀，冷却至室温； 另取0.2%蒽酮-浓硫酸试剂4 mL，加入1 mL 蒸馏水，作为空白。将具塞试管置于沸水浴中加热10 min，冷却至室温，在200～800 nm波长范围内进行扫描。结果，对照品、供试品溶液均在580 nm 处具有最大吸收，故选定其作为最大吸收波长，见图1。

图1 紫外全波长扫描图

3.5 线性关系考察 分别吸取0.108 4 mg/mL 对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、0.9 mL，加蒸馏水至1 mL，在冰水浴中缓慢加入蒽酮-浓硫酸试剂4 mL 混匀，冷却至室温；另取蒸馏水1 mL，同法加入蒽酮-浓硫酸试剂4 mL 混匀，作为空白。将具塞试管置于沸水浴中加热10 min，冷却至室温，于580 nm 波长处测定吸光度，以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝0.007 9X＋0.008 8 （r＝0.999 3），在21.68～97.56 mg/L范围内线性关系良好。

3.6 精密度试验 精密称取同一批样品（Y1） 0.5 g，按“3.4” 项下方法操作，在580 nm 波长处测定吸光度5 次，测得其RSD 为0.85%，表明仪器精密度良好。

3.7 稳定性试验 精密称取同一批样品（Y1） 0.5 g，按“3.4” 项下方法操作，分别于0、0.5、1.0、2.0、3.0 h 以水为空白，在580 nm 波长处测定吸光度，测得其RSD 为0.22%，表明溶液在3.0 h 内稳定性良好。

3.8 重复性试验 精密称取同一批药材（Y1） 5 份，按“3.2” 项下方法制备供试品溶液，以水为空白对照，按“3.4” 项下方法在580 nm 波长处测定吸光度，测得其RSD为1.38%，表明该方法重复性良好。

3.9 加样回收率试验 精密称取总糖含量已知的样品（Y1） 6 份，每份0.25 g，加入1.084 mg/mL 对照品溶液4 mL，按“3.2” 项下方法制备供试品溶液，以水为空白对照，按“3.4” 项下方法在580 nm 波长处测定吸光度，计算回收率，结果见表2。

表2 多糖加样回收率试验结果（n＝6）

3.10 样品含量测定 按“3.2” 项下方法制备供试品溶液，以水为空白对照，在580 nm 波长处测定吸光度，计算含量。

4 防风整体气味测定

4.1 传感器信号分析 PEN 型电子鼻共有10 根金属氧化物传感器，具体如表3 所示。

表3 PEN 型电子鼻标准传感器阵列与性能

4.2 样品方法处理筛选 以样品对传感器响应值为评价指标，筛选称样量、孵化温度、孵化时间。测量条件为手动进样，传感器清洗时间80 s，测定时间60 s，采样时间15 s。

4.3 称样量 取过40 目筛样品，分别精密称取0.3、0.6、1.0、1.5 g 后测定传感器响应值，发现1.0 g 时响应值最高，并且各称样量无明显差异，故确定称样量为1.0 g。

4.4 孵化温度 精密称取过40 目筛的样品1.0 g，分别置于35、45、60 ℃水浴加热40 min 后测定传感器响应值，发现在60 ℃时响应值最高，故确定孵化温度为60 ℃。

4.5 孵化时间 精密称取过40 目筛的样品1.0 g，分别置于60 ℃水浴中孵化20、30、40 min 后测定传感器响应值，发现在30 min 时响应值最高，故确定孵化时间为30 min。

4.6 分析条件 采用直接顶空吸气法，直接将进样针头插入含样品的进样瓶中吸气，测定条件为室温（22±2）℃，采样时间每组15 s，传感器自清洗时间10 s，分析采样时间60 s，每批样品连续测量2 次。以采样时间为横坐标，传感器响应电压为纵坐标绘制响应曲线，结果见图2。

图2 防风对电子鼻的响应曲线

4.7 精密度试验 取样品适量，测定10 个传感器响应值，重复5 次，测得其RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

4.8 样品分析 取样品适量，在“4.6” 项条件下进样分析，平行3 次，取平均值。

5 结果

5.1 色原酮、挥发油、多糖含量与电子鼻传感器响应值 15批样品中色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷）、挥发油、多糖含量测定结果见表4，电子鼻不同传感器响应值结果见表5，可知野生防风各组响应值波动均大于栽培防风和抽薹防风，表明前者气味较浓郁。

表4 防风中主要成分含量测定结果（%）

表5 防风气味响应值测定结果

5.2 传感器分析 Loading 分析是针对电子鼻传感器的分析，可准确计算出10 根传感器的敏感成分信息及区分样品的能力［11］。利用Loading 分析法对防风药材电子信号进行分析，结果见图3，可知7 号传感器（W1W） 和9 号传感器（W2W） 对第一主成分的贡献率最大，5 号传感器（W5C） 对第二成分的贡献率最大。结合表5 可知，7 号传感器对于萜烯类灵敏度较高，9 号传感器对于芳香类灵敏度较高，5 号传感器对于烷烃类灵敏度较高，推测防风挥发性成分可能是萜烯类芳香化合物及烷烃化合物。

图3 Loading 分析结果

5.3 PCA 分析 主成分分析（PCA） 是将数据降维，分为第一、第二主成分贡献率，通过比较两者总贡献率反映原始数据信息，以此判断电子鼻技术对样品的识别能力［12-13］。将3 种样品传感器响应值进行PCA 分析，结果见图4，区分度见表6，可知第一、第二主成分贡献率达99.318%。由表6 可知，抽薹防风和其他2 种防风的区分度较大，但栽培防风和野生防风有部分重合在一起，区分度不够显著。

图4 3 种防风PCA 分析图

表6 3 种防风区分度

5.4 LDA 分析 利用线性判别分析（LDA） 缩小组内差距，扩大组间差距［14］。组间差距越大，差异性越大，若第一、第二主成分之和的贡献率相近，说明样品之间气味值的区分度较小。由图5 可知，3 种防风第一主成分贡献率为27.96%，第二主成分贡献率为16.59%，总区分率为44.55%，表明三者之间的区分度有部分重合，整体区分度不高。

图5 LDA 分析结果

5.5 防风气味与主要成分含量相关性分析 采用SIMCA 14.0 软件中的双变量分析法，对电子鼻传感器响应值与防风主要成分进行相关性分析，结果见图6 ～7。由此可知，色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷） 含量仅与W2S 传感器呈显著正相关，与W5S、W2W 呈显著负相关，说明W2S 传感器响应值越高，该类成分含量越高； 挥发油含量与W6S 和W3S 呈显著正相关，与W5S 和W2W 呈显著负相关，说明前两者传感器响应值越高，该类成分含量越高。

图7 挥发油与防风气味相关性分析图

6 讨论

由3 种防风化学物质含量测定结果可知，野生防风挥发油含量最高，其次是栽培防风，最次为抽薹防风。防风挥发油的组成主要为脂肪族和萜类化合物，具有较好的镇痛、抗炎、止血等作用［15-16］。推测野生防风的药效优于栽培防风可能与其挥发油含量高有关。野生防风的色原酮总量最高，抽薹防风和栽培防风含量相近，15 批样品中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量均符合2020 年版《中国药典》 要求。防风抽薹后色原酮总量并不减少，与文献［17］ 报道一致。栽培防风的多糖含量高于野生防风及抽薹防风，与栽培环境中水、肥等营养物质充足有关［18］。防风在抽薹后多糖含量下降，推测是因为植物进入生长繁殖期后，大量的多糖营养物质转化为其他成分。

本实验借助电子鼻对不同防风粉末的整体气味进行客观化表达。对3 种防风进行气味与化学成分之间相关性的分析得出，防风中响应值较高的是萜烯类芳香性化合物，该结果与文献［19］ 报道一致。根据电子鼻对气味的响应值来看，野生防风＞抽薹防风＞栽培防风。而当色原酮的含量较高时，其在电子鼻的响应值也较高，可见气味与化学成分的含量具有一定的相关性。结合SIMCA 软件对防风电子鼻气味值与色原酮类、挥发油含量进行相关性分析，可以得出W2S 传感器、W3S 和W6S 传感器与色原酮类、挥发油含量呈显著正相关，传感器响应值越高，防风中所对应的成分含量越高。综上所述，可根据电子鼻中W2S、W3S 和W6S 传感器响应值判断防风中色原酮类与挥发油的含量，但气味浓郁程度是否会影响药效发挥还需要进一步研究。