加味百合地黄汤通过调控SDF-1/CXCR4 轴对围绝经期抑郁症大鼠下丘脑炎性损伤的改善作用

刘 洋，李翎熙，周 密，吴敏学，王宇红，赵洪庆

（湖南中医药大学科技创新中心/中药粉体与创新药物国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208）

围绝经期抑郁症（perimenopausal depressive disorder，PDD） 是中老年女性常见的情感障碍性精神疾病，严重者会出现自闭、妄想、自残、躯体化障碍等症状行为，严重影响患者生活质量。PDD 病理机制目前仍聚焦于神经内分泌的改变，即内分泌轴功能改变引发脑内神经递质变化及神经传导障碍［1］。炎症激活是机体神经内分泌失衡后常见的继发反应，但其在PDD 病理进程中的作用尚缺乏深入研究。小胶质细胞（microglia，MG） 主要调控机体神经免疫，是抑郁症病理改变的重要结构基础［2-3］。基质细胞衍生因子-1 （stromal cell-derived factor-1，SDF-1） 对MG 具有特殊趋化作用，其与趋化因子受体-4 （chemokine receptor-4，CXCR4） 结合后生理状态下能促进神经元发育与受损神经元修复，但当其过度表达后可参与MG-神经元相互作用引起神经炎症微环境，导致抑郁症状产生［4］。

加味百合地黄汤以《金匮要略》 百合地黄汤为基础加味而成，具有补益气血、调和阴阳、活血安神的功效，主治妇女围绝经期抑郁、焦虑、失眠病证，与原方相比，其活血清心之力更甚，兼具补益之功，与中医抗PDD 病机更为契合。该方能改善PDD 模型大鼠的抑郁样行为，调节雌激素水平，抑制下丘脑-垂体-卵巢（HPO） 轴功能紊乱，增加脑内雌激素受体表达，但具体机制尚不明确。本研究将围绕神经炎症探讨加味百合地黄汤治疗PDD 的作用机理，为其后续应用提供理论支撑。

1 材料

1.1 动物 60 只SPF 级健康雌性SD 大鼠，体质量200 ～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （湘） 2019-0004］，饲养于湖南中医药大学实验动物中心［实验动物使用许可证号SYXK （湘）2019-0009］。本实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理号LLBH-202206280001）。

1.2 药物 加味百合地黄汤由百合30 g、生地黄9 g、麦冬9 g、苏叶6 g、夜交藤15 g、郁金9 g、五味子6 g、白芍6 g 组成，饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院，经湖南中医药大学王宇红研究员鉴定为正品，质量均符合2020年版《中国药典》 规定，混匀后分别加入10、6 倍量水，提取2 次，合并2 次提取液，浓缩至生药量1.62 g/mL。阳性药为氟哌噻吨美利曲辛片（丹麦H.Lundbeck A/S 公司，国药准字H20171104，批号2691302）。

1.3 试剂 白细胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-4、IL-10、胰岛素样生长因子-1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1） 酶联免疫吸附试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号2209R21、2209R23、2209R35、2209R32、2209R46）； RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，批号E096-01、E047-01）； 离子钙接头蛋白1 （ionized calcium binding adapter 1，Iba-1）、SDF-1、CXCR4 一抗（美国Proteintech 公司，批号10904-1-AP、17402-1-AP、11073-2-AP）。

1.4 仪器 G3 型旋转蒸发仪 （德国Heidolph 公司）；Tracking Master V3.0 系统（香港博睿唯思科技公司）； MK3型酶标仪（美国Thermo 公司）； Axio Scan.Z1 全自动数字玻片扫描系统（德国Zeiss 公司）； ChemiDoc XRS＋型凝胶成像分析系统、实时荧光定量PCR 仪 （美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 分组与造模 将60 只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药（氟哌噻吨美利曲辛片） 组和加味百合地黄汤高、中、低剂量组，每组10 只。参考文献［5］ 报道，采用双侧卵巢摘除（ovariectomized，OVX） 联合慢性不可预见性应激（chronic unpredictable stress，CUS） 的方法建立PDD模型，其中OVX 为模拟人围绝经期状态的常用模型，以连续5 d 阴道涂片未见动情周期表示模型建立成功； CUS 为模拟抑郁状态的经典模型，以动物出现快感缺失、活动受限、行为绝望等行为表征表示模型建立成功。实验期间，大鼠均单笼饲养。

2.2 给药与取材 在CUS 造模7 d 后开始灌胃给药，阳性药物给予目前临床治疗PDD 的首选药物氟哌噻吨美利曲辛片溶液（1.89 mg/kg），加味百合地黄汤高、中、低剂量组分别给予相应药液（16.2、8.1、4.05 g/kg），正常组与模型组给予等量蒸馏水，灌胃容积为10 mL/kg，共21 d。给药结束后进行行为学检测，之后麻醉大鼠，腹主动脉取血，脑立体定位仪固定，采用微量注射器从枕骨大孔抽取脑脊液，留取脑组织或分离下丘脑组织备用。

2.3 行为学检测

2.3.1 糖水偏好实验 参考文献［6］ 报道，实验分为适应与测试2 个阶段。适应期间第1 天给予每只大鼠2 瓶2%蔗糖水，第2 天给予蔗糖水、蒸馏水各1 瓶，并在12 h 时切换两者位置，然后禁水不禁食12 h； 测试时同时给予大鼠1 瓶蔗糖水与1 瓶蒸馏水，记录2 h 内糖水与蒸馏水的摄入量，为避免位置偏好，于测试1 h 时调换两者位置，计算糖水偏好率，公式为糖水偏好率＝ ［糖水摄入量/（糖水摄入量＋蒸馏水摄入量）］ ×100%。

2.3.2 旷场实验 参考文献［7］ 报道，在测试空间提前适应12 h 以上，采用80 cm×80 cm×40 cm 大鼠专用旷场箱，Tracking Master V3.0 系统将其底部均匀划分为25 个方格，将大鼠从中央放入，自由活动30 s 后记录其4 min 内自主活动距离。

2.4 酶联免疫吸附实验检测炎症因子水平 大鼠脑脊液收集完成后4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，取上清液，按照酶联免疫吸附试剂盒说明书检测促炎因子IL-1β、IL-6 与抗炎因子IL-4、IL-10、IGF-1 水平。

2.5 HE 染色观察脑组织病理变化 取充分固定后的大鼠脑组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备5 μm 切片，烤干后脱蜡，水洗，苏木素、伊红先后染色，常规脱水透明后封片，于显微镜下观察，采用数字玻片扫描仪对切片进行扫描，观察下丘脑区域病理变化。

2.6 免疫荧光染色检测脑组织Iba-1 表达 取大鼠脑组织切片（10 μm），用PBST 溶液浸泡30 min，再用含5%正常山羊血清的PBST 液在室温下封闭1 h，加入稀释后的一抗，在4 ℃下孵育过夜，次日取出切片，用PBST 溶液洗涤3 次，加入二抗室温避光孵育1.5 h，再次洗涤，滴加抗荧光淬灭剂，封片，扫描，选取下丘脑区3 个视野，通过Image J 软件计算平均荧光强度。

2.7 Western blot 法检测脑组织SDF-1、CXCR4 蛋白表达 取大鼠下丘脑组织，加入组织裂解液，于冰上匀浆，静置30 min 后离心取上清液，检测蛋白浓度，制胶，蛋白上样量为30 μg，经电泳、转膜后脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，洗膜后加入稀释后的一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜后加入稀释后的二抗于室温下孵育2 h，洗膜，滴加显影液，化学发光法显影，通过Image J 软件分析目的蛋白与内参的灰度值，并计算前者相对表达。

2.8 RT-qPCR 法检测脑组织各基因mRNA 表达 采用RNA 提取试剂盒提取脑组织样本总RNA，并将其逆转录成cDNA，进行PCR 反应，条件为95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 个循环。测定目的基因和内参基因β-actin的PCR 产物CT值，采用2-ΔΔCT法分析前者mRNA 相对表达。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.9 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，齐时采用LSD-t检验，不齐时采用Dunnett-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 加味百合地黄汤对PDD 大鼠抑郁样行为的影响 与正常组比较，模型组大鼠糖水偏好率、自主活动距离减少（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和加味百合地黄汤高剂量组大鼠糖水偏好率、自主活动距离增加（P＜0.01），中剂量组糖水偏好率增加（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠糖水偏好率和自主活动距离比较（±s，n＝10）

表2 各组大鼠糖水偏好率和自主活动距离比较（±s，n＝10）

注： 与正常组比较，**P ＜0.01； 与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别糖水偏好率/%自主活动距离/cm正常组75.54±9.861 595.1±606.7模型组44.40±15.47**917.6±344.0**阳性药组66.83±12.16＃＃1 380.4±440.3＃＃加味百合地黄汤高剂量组78.00±12.69＃＃1 453.1±577.0＃＃加味百合地黄汤中剂量组65.36±18.00＃1 265.4±612.3加味百合地黄汤低剂量组63.39±19.531 210.9±427.8

3.2 加味百合地黄汤对PDD 大鼠脑脊液炎症因子水平的影响 与正常组比较，模型组脑脊液内促炎因子IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.01），抗炎因子IL-4、IL-10、IGF-1水平降低（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组IL-6 水平降低（P＜0.01），IL-4、IL-10、IGF-1 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），加味百合地黄汤高剂量组IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-4、IL-10、IGF-1 水平升高（P＜0.01），中剂量组IL-6 水平降低 （P＜0.05），IL-4、IGF-1 水平升高（P＜0.01），低剂量组IL-6 水平降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠脑脊液炎症因子水平比较（pg/mL，±s，n＝6）

表3 各组大鼠脑脊液炎症因子水平比较（pg/mL，±s，n＝6）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别IL-1βIL-6IL-4IL-10IGF-1正常组247.2±25.4447.5±55.153.1±6.3126.7±13.7517.1±67.2模型组323.7±31.2**557.0±49.2**37.1±4.4**94.4±7.2**309.2±35.7**阳性药组298.3±27.5483.3±35.9＃＃51.9±4.6＃＃109.5±10.8＃435.1±22.9＃＃加味百合地黄汤高剂量组271.6±20.2＃468.7±43.0＃＃62.2±7.5＃＃118.4±13.8＃＃422.9±35.9＃＃加味百合地黄汤中剂量组289.2±25.1477.4±48.5＃53.0±4.5＃＃103.8±8.5382.5±40.5＃＃加味百合地黄汤低剂量组325.6±36.6490.0±38.9＃42.3±5.598.9±7.1350.4±32.3

3.3 加味百合地黄汤对PDD 大鼠下丘脑组织形态的影响 正常组下丘脑神经元形态正常，结构完整，胞核清晰，未见损伤； 模型组神经元出现核固缩、深染，部分胞体空泡、肿胀，间隙增大，密度降低，可见炎性细胞浸润； 各给药组下丘脑整体损伤情况得到一定程度的缓解，神经元密度增大，胞核清晰，但仍可见少量核固缩与炎性浸润情况，其中以加味百合地黄汤高剂量组效果最强，见图1。

图1 各组大鼠下丘脑组织HE 染色

3.4 加味百合地黄汤对PDD 大鼠下丘脑小胶质细胞激活的影响 如图2～3 所示，与正常组比较，模型组下丘脑小胶质细胞染色数量增加，可见明显的分支，Iba-1 荧光强度与mRNA 表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和加味百合地黄汤高、中剂量组小胶质细胞激活程度减轻，Iba-1 荧光强度与mRNA 表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 各组大鼠下丘脑Iba-1 荧光表达（±s，n＝3）

图3 各组大鼠下丘脑Iba-1 mRNA 表达（±s，n＝3）

3.5 加味百合地黄汤对PDD 大鼠下丘脑SDF-1/CXCR4 轴相关基因表达的影响 与正常组比较，模型组下丘脑SDF-1、CXCR4 mRNA 表达升高 （P＜0.01），PSD-95、BDNF、NGFmRNA表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和加味百合地黄汤高、中剂量组SDF-1、CXCR4 mRNA表达降低 （P＜0.05，P＜0.01），PSD-95、BDNF、NGFmRNA 表达降低 （P＜0.05，P＜0.01），低剂量组BDNFmRNA 表达升高（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠下丘脑SDF-1/CXCR4 轴相关基因表达比较（±s，n＝3）

表4 各组大鼠下丘脑SDF-1/CXCR4 轴相关基因表达比较（±s，n＝3）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别SDF-1CXCR4PSD-95BDNFNGF正常组1.018±0.0161.055±0.0501.080±0.0681.089±0.0780.995±0.029模型组1.613±0.072**1.528±0.064**0.504±0.048**0.472±0.081**0.476±0.041**阳性药组0.958±0.045＃＃0.949±0.269＃0.828±0.127＃0.775±0.088＃0.940±0.155＃＃加味百合地黄汤高剂量组0.931±0.280＃0.960±0.109＃＃0.936±0.039＃＃0.813±0.074＃＃0.733±0.115＃加味百合地黄汤中剂量组0.893±0.102＃＃1.007±0.125＃＃0.884±0.147＃0.808±0.134＃0.719±0.121＃加味百合地黄汤低剂量组1.294±0.1481.275±0.1690.606±0.0260.707±0.076＃0.524±0.063

3.6 加味百合地黄汤对PDD 大鼠下丘脑SDF-1/CXCR4 轴蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组下丘脑SDF-1、CXCR4 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和加味百合地黄汤高、中剂量组SDF-1、CXCR4 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），见图4。

图4 各组大鼠下丘脑SDF-1、CXCR4 蛋白表达（±s，n＝6）

4 讨论

PDD 临床症状与中医古籍中“百合病” “脏躁” “卑惵” 等病症相似，五脏虚损是其发病之本，血脉瘀阻是发病之标，由虚致瘀，因瘀致郁是该病基本发生过程，治疗当以补虚扶正、活血安神，系统性调节。加味百合地黄汤以张仲景《金匮要略》 百合地黄汤为基础，基于PDD 病机根本，加味郁金、白芍、麦冬、夜交藤、茯神、苏叶等药物而成。方中百合调和五脏、养心安神，兼具补益功效，为君药； 生地黄偏于泻，能清热生津、滋阴凉血，白芍偏于补，能养血荣筋、柔肝缓急，郁金行气活血，善破血瘀气结，使机体气机通达，兼能清心开窍而安神，麦冬润肺清心、养阴生津，可助百合调和之功，四者共为臣药； 夜交藤、茯神味甘性平，均有宁心安神之功，夜交藤还能调和阴阳，苏叶调和脾胃，三者共为佐药。大量临床研究表明，百合地黄汤加减治疗原发性抑郁症和继发性抑郁症均有显著的疗效［8］，联合氟哌噻吨美利曲辛片治疗PDD 总有效率及不良反应发生率均优于单一用药组［9］。现代药理研究也发现，百合、生地黄、郁金、白芍等单味药均具有良好的抗抑郁功效［10］，苏叶挥发油也是潜在的具有开发前景的抗抑郁药物［11］。白芍、茯神、夜交藤均为治疗围绝经期综合征的常用中药，其中白芍为用药频次最高的药物［12］。诸药合用，共奏“补益气血、调和阴阳、活血安神” 之功，通过多种有效成分有机合理的组合，多途径作用于机体，最大限度发挥抗围绝经期抑郁的功效。

绝经前后通常伴随着卵巢功能的严重衰退，并影响HPO 轴的平衡，使雌激素分泌减少，进而减弱下丘脑负反馈调节作用，导致下丘脑处于持续兴奋状态，容易诱发精神疾病［13］。MG 作为脑内第一道免疫防线，正常状态下，在保护大脑正常活动及中枢神经系统的组织维持、损伤反应和病原体防御等方面发挥重要作用，并作为吞噬细胞维持组织内平衡［14］； 而病理状态下，受病理刺激的MG 迅速激活并表现出双重功能，一方面介导炎性反应，刺激促炎细胞因子和炎症介质如IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 等的分泌［15］，另一方面也可以释放抗炎细胞因子如IL-10、IGF-1等拮抗炎症级联反应［16］。研究表明，慢性应激可诱导下丘脑MG 过度激活，导致其形态功能改变，该过程可能与下丘脑所调控的下丘脑-垂体-肾上腺轴异常兴奋有关［17］。本研究发现，模拟围绝经期大鼠接受慢性应激后，下丘脑神经元胞体肿胀，间隙增加，炎性细胞浸润，MG 分支增加，其标志蛋白Iba-1 表达增加，脑脊液中促炎因子水平增加而抗炎因子降低，进一步说明该模型大鼠下丘脑处于明显的炎症激活状态。

SDF-1/CXCR4 轴失调可能是激活MG 的重要环节。正常脑组织中，神经元、胶质细胞和血管内皮细胞可持续低水平表达SDF-1 和CXCR4； 慢性不可预见性应激条件下，SDF-1 表达异常或者其与CXCR4 受体的特异性结合被干扰，使SDF-1/CXCR4 轴介导的信号转导通路失去活性，神经元/胶质细胞迁移到受损脑组织的作用减弱，影响损伤神经元的自我修复作用［18］。研究显示，脑区受损部位的SDF-1/CXCR4 通路相关蛋白表达增加，导致炎症因子聚集，神经元受损［19］。SDF-1 能够促进脑内MG 的迁移与表达，病理条件下也能促进其活化与增殖，通过与CXCR4 受体结合，可参与MG-星形胶质细胞-神经元相互作用引起的神经炎症微环境，引发神经炎症失衡及神经元自我修复障碍［20］。本研究也发现，PDD 模型大鼠SDF-1、CXCR4 表达增加，突触结构蛋白PSD-95 以及与神经元生长修复相关的BDNF、NGF 表达均降低，而加味百合地黄汤能够逆转上述因子表达，并抑制MG 的过度激活，调节促炎/抗炎因子的分泌水平，保护下丘脑组织。

综上所述，加味百合地黄汤对PDD 大鼠的改善作用与其调节SDF-1/CXCR4 轴抑制MG 过度激活，改善下丘脑神经炎性损伤有关，为该方治疗PDD 的临床应用提供了重要理论依据。