川芎挥发油环糊精包合物种类、质量比筛选

李 超，刘云华，刘玉红，黄志芳，陈 燕，易进海*

（1.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000； 2.四川省中医药科学院中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室，四川 成都 610041）

川芎挥发油为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.根茎中的重要有效部位之一，其主要成分为苯酞内酯类化合物，以高含量的藁本内酯、洋川芎内酯A 为代表［1］，临床上常用于治疗偏头痛、心脑血管疾病等［2-4］，但由于苯酞类成分稳定性、水溶性、生物利用度差，大大限制了其临床应用。

β-环糊精、羟丙基-β-环糊精是目前中药制剂中应用最广泛的包合材料，具有较好的溶解性、安全性、稳定性，还可在一定程度上提升生物利用度。钟应淮等［5］发现，藁本内酯等苯酞类成分在大鼠体内存在较强的首过效应，制成β-环糊精包合物后其生物利用度增加了2.2 倍。周成梁等［6］报道，藁本内酯生物利用度差，经β-环糊精包合后可增加2.7 倍。

研究药物稳定性、预测有效期是保证制剂质量和临床疗效的关键。目前，关于挥发油包合物的研究大多涉及包合方法的筛选、工艺参数的优化，以损失量少、包合率高为目的，但挥发油成分在包合物中的稳定性鲜有报道。藁本内酯极不稳定，温度是影响其稳定性的首要因素［7-8］，本实验采用经典恒温加速试验对川芎挥发油环糊精包合物进行热稳定性研究，依据阿伦尼乌斯方程的热降解动力学原理进行有效期预测，筛选其种类、质量比，以期解决川芎挥发油及其相关制剂的稳定性难题。

1 材料

1.1 仪器 DNP-9052 型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）； ZKF035 型电热真空干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）； XY3000-2C 型电子天平（上海巍鑫电子商务有限公司）； SECURA225D-1CN 型分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器 （北京） 有限公司］； Milli-Q Integral 3 型超纯水机（美国Millipore 公司）； HSY2-SP 型恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）； C-MAGHS7 型加热磁力搅拌器（德国IKA 公司）； Sorvall LYNX 4000 型高速离心机（美国Thermo 公司）； SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）； Rotavapor R-220SE型旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）； KQ-300E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）。

1.2 试剂与药物 川芎挥发油（实验室自制，藁本内酯、洋川芎内酯A 含量分别为48.18%、16.96%）。羟丙基-β-环糊精（批号HP20211025）、β-环糊精（批号20220625）（山东滨州智源生物科技有限公司）。丁苯酞对照品（中国食品药品检定研究院，批号101035-202104）。甲醇为色谱纯； 石油醚（60～90 ℃） 等其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 羟丙基-β-环糊精包合物制备 采用课题组前期建立的单相法［9］。分别按质量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15称取羟丙基-β-环糊精，溶于3 倍量95%乙醇中，加入川芎挥发油混合均匀，回收乙醇，在65 ℃下真空干燥，粉碎，过80 目筛，即得。

2.2 β-环糊精包合物制备 以饱和水溶液法为基础，进一步优化后采用超声搅拌法［10］。分别按质量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15 称取β-环糊精，溶于10 倍量蒸馏水中，在超声搅拌条件下将川芎挥发油（用等量95%乙醇稀释） 缓慢滴加到β-环糊精溶液中，混合均匀，磁力搅拌（温度55 ℃，转速750 r/min） 30 min，冷却至室温，在4 ℃下冷藏24 h，离心（8 000 r/min、25 ℃） 10 min，底部沉淀在65 ℃下减压干燥，粉碎，过80 目筛，即得。

2.3 有效成分含量测定 由于藁本内酯、洋川芎内酯A 对照品不稳定，故2020 年版《中国药典》 尚未收载两者含量测定方法。本实验采用课题组前期报道的一测多评法［11］，以丁苯酞为内标，同时测定藁本内酯、洋川芎内酯A 含量，后两者相对校正因子分别为0.226 3、0.490 7。

2.3.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流动相甲醇-水（52 ∶48）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长280 nm； 进样量5 μL。理论塔板数按丁苯酞计，应不低于3 000［11］。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取丁苯酞对照品适量，甲醇稀释至刻度，制成每1 mL 含178.3 μg 该成分的溶液，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 取包合物粉末约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率300 W，频率40 kHz） 处理30 min，放冷，70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 包合率测定 参考文献［10］ 报道，采用70% 乙醇超声提取测得包合物总药量； 石油醚超声洗涤2 次，合并滤液和洗液，减压回收石油醚，95% 乙醇溶解，测得未包合药量，计算包合率，公式为包合率＝ ［（包合物中该成分总量-未包合该成分量） /包合物中该成分总量］ ×100%，结果见图1～2。由此可知，洋川芎内酯A 包合效果优于藁本内酯； 随着羟丙基-β-环糊精用量增加，包合率明显升高； 质量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15 的β-环糊精包合率无明显差异，但为1 ∶4、1 ∶6 时显著降低，分别仅为53%、82%，与文献［12-13］ 报道一致，其原因是随着β-环糊精用量增加，它所提供的分子空腔数由最初的不足逐渐变为过量，从而包合率不会持续升高，同时该现象还可能与羟丙基-β-环糊精包合类型为AL型，β-环糊精包合类型为AN型有关［14-15］。

图1 不同比例羟丙基-β-环糊精对包合率的影响

图2 不同比例β-环糊精对包合率的影响

2.5 经典恒温加速试验 预试验显示，包合物中藁本内酯在高温条件下的降解速率显著大于洋川芎内酯A，对热更不稳定，故本实验选择藁本内酯作为指标成分进行热稳定性考察。分别精密称取质量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15 羟丙基-β-环糊精包合物各4 份，装入干燥洁净的称量瓶中（高约5 mm），密封，分别置于60、70、80、90 ℃恒温烘箱中； 另取相同质量比β-环糊精包合物，分别置于80、90、100、110 ℃恒温烘箱中，于设计时间点取出，在冰水浴中迅速冷却以终止反应，取样，根据减失质量测定含量，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，结果见表1～2。

表1 羟丙基-β-环糊精包合物中藁本内酯经典恒温试验结果

表2 β-环糊精包合物中藁本内酯经典恒温试验结果

2.5.1 反应级数确定 采用Excel 2019 软件将包合物中藁本内酯相对浓度（保留量） （C） 的对数lgC与任一温度下时间t进行线性回归（以lgC为Y轴，t为X轴），结果见表3～4。由此可知，r均大于0.99，表明线性关系显著，一级动力学方程拟合较好，即羟丙基-β-环糊精、β-环糊精包合物中藁本内酯降解均遵循一级动力学过程。

表3 羟丙基-β-环糊精包合物中藁本内酯在不同温度下的降解反应方程

表4 β-环糊精包合物中藁本内酯在不同温度下的降解反应方程

2.5.2 反应速率常数确定 一级动力学方程为lgC＝- （K/2.303）t＋lgC0，斜率为K/2.303，其中K为根据一级动力学降解反应拟合所得包合物在不同温度下的降解速度常数，结果见表3～4。

2.5.3 有效期预测 根据Arrhenius 方程，以4 个温度下降解速度常数的对数lgK对绝对温度的倒数1/T进行线性回归［16-17］，结果见图3～4、表5 ～6，可知各方程线性关系均显著。Arrhenius 方程指数定律为lgk＝-E/2.303RT＋lgA［T为绝对温度，斜率为-E/2.303R，A为频率因子，E为反应活化能，R为理想气体常数（8.314 J/mol）］，将25 ℃（T＝298.2 K） 代入上述方程，测得不同质量比包合物在室温下的降解速度常数K25℃，以藁本内酯含量降低至初始含量90%的有效期t0.9进行计算（t0.9＝0.105 4/K25℃），结果见表5～6。另外，各包合物降解反应活化能E均在41.84～125.52 kJ/mol 范围内，即适用于Arrhenius 指数定律进行有效期预测，为了使其稳定性满足药物有效期要求，而且环糊精用量小，生产成本低，最终确定为质量比1 ∶8 β-环糊精包合物。

表5 羟丙基-β-环糊精包合物经典恒温有效期测定结果

表6 β-环糊精包合物经典恒温有效期测定结果

图3 不同比例羟丙基-β-环糊精线性回归曲线

图4 不同比例β-环糊精线性回归曲线

3 讨论

研究表明，川芎挥发油羟丙基-β-环糊精、β-环糊精包合物稳定性与环糊精用量呈正相关，并且在一定范围内包合率也与环糊精用量呈正相关，其原因是环糊精量较少时，所提供的分子空腔不足以满足需求，而随着其用量增多分子腔逐渐过量，包合状态达到饱和［12-13］。另外，室温下羟丙基-β-环糊精包合物有效期均较短（＜18 个月），难以满足药物稳定性要求，而β-环糊精包合物稳定性显著更优，其中质量比为1 ∶8 时有效期长达4 年。

包合物的稳定性不仅与包合率相关，而且与包合物主-客体结构特征也有密切关联。前期报道，由于β-环糊精分子腔疏水作用力的存在［18］，藁本内酯中极性较小的3-丁烯基先进入其空腔内部，而极性较大的羰基、不稳定的6，7-碳碳双键位于其端口，前者可与端口上的羟基形成分子间氢键［19］，后者则可通过与端口羟基的分子间相互作用来增加键合强度，从而加强该成分稳定性； 羟丙基-β-环糊精由于引入了亲水性的羟丙基取代基［20］，导致其分子空腔的疏水作用力减弱［21］，还产生了明显的空间位阻效应［22］，使得主-客体间相互作用力减弱，同时羟丙基取代基还可形成分子内自包结配合物［23-24］，从而降低其对客分子的键合能力，故川芎挥发油β-环糊精包合物稳定性显著优于羟丙基-β-环糊精包合物。上述结果对川芎挥发油包合物有效期的准确预测，以及其质量稳定可控和相关制剂开发具有重要意义。