基于自噬途径探讨银杏叶提取物对老年性聋大鼠的保护作用

王青玲，张梦娴，周颍东，康浩然，郭向东*，王庆林

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000； 3.河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191）

老年性聋是老年人最常见的一种感觉障碍，其发病机制十分复杂，迄今为止尚无有效措施减轻耳蜗细胞的损伤，改善听觉功能的预后［1-2］。老年性聋的病理改变主要是耳蜗内毛细胞 （inner hair cell，IHC）、外毛细胞（outer hair cell，OHC）、血管纹 （stria vascularis，SV）、螺旋韧带 （spiral ligament，SL）、螺旋神经节细胞 （spiral ganglion cells，SGC） 等变性［3］，但其发病机制尚未阐明。既往研究表明，自噬对耳蜗的发育和功能成熟起重要作用，上调可减轻耳蜗细胞损伤，防止听力下降，而下调可能是导致耳蜗细胞衰老失活的重要原因之一［4］。

银杏叶提取物已被广泛应用于临床，多项专家共识指出它对突发性聋、耳源性眩晕、神经血管性疾病等具有较好的临床疗效，对于延缓老年性聋也有一定的作用［5-6］，实验研究也证实其可通过调节耳蜗细胞自噬与凋亡来减轻噪声性耳聋。因此，本实验通过建立老年性聋大鼠模型，观察银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗组织形态学和听功能的影响，以及对耳蜗组织中自噬相关蛋白的调节作用，深入探究其延缓耳蜗细胞衰老的机制，以期为临床治疗老年性聋提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 听阈正常的雄性SPF 级SD 大鼠45 只，8 周龄，体质量（220±10） g，由郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供［实验动物生产许可证号SCXK（豫） 2019-0002，合格证号4109812011000 11477］，饲养于河南中医药大学实验动物中心［实验动物使用许可证号SYXK （豫） 2017-0001］，SPF级饲养环境，室内温度（24±3）℃，自由饮食和摄水，实验前适应性饲养1 周。研究方案经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准 （伦理号DWLL202203009），实验过程遵循实验室规则，对实验动物遵循3R 原则给予人道关怀和保护。

1.2 试剂与药物 BCA 试剂盒、2.5% 戊二醛、DAPI 溶液 （北京索莱宝科技有限公司，批号PC0021、P1126、C0060）； 10%水合氯醛（广州艾肯曼生物科技有限公司，批号DM0001）； Beclin1、LC3、P62 抗体 （ 美国 GeneTex 公司，批号GTX55535、GTX127375、GTX128171）； Myosin-Ⅶa 抗体（美国Protrus BioSciences 公司，批号25-6790）； Alexa Flour 488 抗体（美国Jackson 公司，批号111-545-003）； 内参抗体GAPDH、SDS-PAGE快速凝胶试剂盒［攸碧艾（上海） 贸易有限公司，批号UBI6010、UBI3002］。银杏叶提取物（金纳多，台湾济生医药生技股份有限公司，批号HC20090014）。

1.3 仪器 听觉诱发电位仪（美国智听公司）；JY-BMB 型石蜡包埋机、JY-QPC 冷冻切片机（湖北锦源医疗科技有限公司）； RM2135 型轮转切片机（德国徕卡公司）； KD-P 型摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）； PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）； DGG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）； 3K15 型低温高速离心机（美国Sigma公司）； VE-186 型转膜仪、EPS300 型电泳仪、VE-180 型电泳槽、VE-186 型转膜仪（上海天能科技有限公司）； JEM-1400 型透射电子显微镜（日本JEOL 公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 45 只大鼠随机分为对照组、模型组和银杏叶提取物低、中、高剂量组（10、20、30 mg/kg），每组9 只，对照组大鼠每天皮下注射500 mg/kg 生理盐水，模型组和银杏叶提取物各剂量组大鼠每天皮下注射500 mg/kgD-gal，连续8 周。8 周后，银杏叶提取物低、中、高剂量组大鼠腹腔注射10、20、30 mg/kg 银杏叶提取物，对照组和模型组大鼠腹腔注射等体积0.9%生理盐水，每天1 次，连续8 周。

2.2 听性脑干诱发电位（ABR） 阈值检测 大鼠麻醉后连接电极，以Tone 为刺激音，从80 dBSPL开始以10 dBSPL 递减，接近阈值时以5 dBSPL 递减，分别记录4、8、16、24、32 kHz 频率对短纯音刺激的反应，直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激强度确定反应阈值。

2.3 HE 染色观察耳蜗组织病理学 耳蜗组织经固定、脱钙、梯度脱水、包埋、连续切片、烤片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木素染色、盐酸酒精分化、伊红复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片后，在光学显微镜下用Image View 进行拍照，并对底回耳蜗毛细胞、血管纹、螺旋神经节细胞等形态和数量变化进行记录。

2.4 免疫荧光染色观察耳蜗内外毛细胞数 分离耳蜗基底膜，铺片，10%山羊血清封闭通透，4 ℃冰箱放置过夜，一抗（rabbit anti-Myosin-Ⅶa） 孵育过夜，二抗（Alexa Flour 488 donkey anti-rabbit）避光孵育2 h，DAPI 室温孵育15 min，抗猝灭甘油（Fluoromount-GTM） 封片，采用Image View 进行拍照，在荧光显微镜下分别对各组大鼠耳蜗底回100 μm 内外毛细胞存活数进行计数。

2.5 透射电子显微镜观察耳蜗毛细胞超微结构耳蜗置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定24 h，脱钙1 周，取下基底膜，1%锇酸4 ℃固定2 h，梯度乙醇浸没，丙酮脱水，将组织包埋在环氧树脂中，进行超薄切片，切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅双染色20 min，水洗，烘干，使用透射电子显微镜拍照。

2.6 Western blot 法检测耳蜗组织Beclin1、LC3、P62 蛋白表达 液氮冷冻耳蜗组织，取下其蜗轴与基底膜，称取20 μg 组织用匀浆机破碎，加入250 μL 裂解液，冰上裂解10 min，离心30 min，取上清，按照BCA 试剂盒说明书进行蛋白定量后加热变性。制备凝胶，蛋白样本经电泳、转膜、封闭后，加入Beclin1 （1 ∶1 500）、LC3 （1 ∶1 500）、P62 （1 ∶1 500） 和GAPDH （1 ∶1 000） 一抗工作液，在4 ℃冰箱中孵育过夜，次日洗膜后加入HRP 标记的二抗（1 ∶1 000），在摇床上孵育2 h，洗膜后滴加ECL 超敏发光液，通过Image Lab 成像系统显影，采用Image J 软件对蛋白条带的灰度值进行测量，以GAPDH 为内参计算目的蛋白相对表达。

2.7 统计学分析 通过SPSS 25.0、GraphPad Prism 8 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，进一步两两比较采用LSD 检验； 方差不齐时，采用Dunnett多重比较检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 银杏叶提取物对老年性聋大鼠ABR 阈值的影响 治疗前，与对照组比较，其余4 组ABR 阈值在4、8、16、24、32 kHz 时均提高（P＜0.01），并且组间无差异（P＞0.05），见图1A。治疗后，与模型组比较，银杏叶提取物各剂量组ABR 阈值在4、8、16、24、32 kHz 时均降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高剂量组低频4、8 kHz 时对听力的改善程度最佳，见图1B。

图1 银杏叶提取物对老年性聋大鼠ABR 阈值的影响（±s，n＝9）Fig.1 Effects of G.biloba extract on ABR threshold of presbycusis in rats （±s，n＝9）

3.2 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗病理形态的影响 对照组毛细胞、血管纹、螺旋神经节细胞等形态均正常，轮廓清晰，胞浆饱满，胞核排列整齐、均匀一致； 与对照组比较，模型组毛细胞及纤维断裂、折叠、丢失，血管纹厚度萎缩 （P＜0.01），螺旋韧带密度降低，螺旋神经节细胞出现大量丢失（P＜0.01），螺旋神经节细胞出现大量空泡样变，细胞核变形、溶解、甚至消失； 与模型组比较，银杏叶提取物低剂量组耳蜗细胞形态变化不明显，中、高剂量组毛细胞形态改善，血管纹厚度增加（P＜0.01），螺旋韧带形态逐渐趋于正常，螺旋神经节细胞数量增多（P＜0.01），并且胞浆饱满，细胞核逐渐变大，空泡样变性逐渐减轻，见图2、表1。

表1 各组大鼠耳蜗血管纹厚度和螺旋神经节细胞数量比较（±s，n＝9）Tab.1 Comparison of thicknesses of cochlear stria and number of spiral ganglion cells in rats of each group （±s，n＝9）

表1 各组大鼠耳蜗血管纹厚度和螺旋神经节细胞数量比较（±s，n＝9）Tab.1 Comparison of thicknesses of cochlear stria and number of spiral ganglion cells in rats of each group （±s，n＝9）

注： 与对照组比较，△△P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别血管纹厚度/μm 螺旋神经节细胞数量/个对照组52.56±5.8746.15±2.25模型组20.85±4.79△△21.86±1.96△△银杏叶提取物低剂量组21.17±3.2622.65±2.92银杏叶提取物中剂量组40.75±6.83＃＃31.53±1.68＃＃银杏叶提取物高剂量组42.85±4.62＃＃37.27±0.53＃＃

图2 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗病理形态的影响（×200）Fig.2 Effects of G.biloba extract on pathological morphology of cochlea in presbycusis rat models （×200）

3.3 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗毛细胞形态及存活数的影响 本实验中Myosin-Ⅶa 抗体在毛细胞胞浆中表达呈绿色荧光，DAPI 为细胞核染色呈蓝色荧光，Merge 为毛细胞胞浆、胞核组合呈蓝绿色荧光。图3 显示，对照组一排内毛细胞和三排外毛细胞的胞核及胞浆排列整齐，轮廓清晰，结构规整； 模型组大量外毛细胞和部分内毛细胞丢失、坏死，毛细胞存活数降低（P＜0.01），残存的内、外毛细胞形态变性、结构紊乱，细胞间出现融合； 与模型组比较，银杏叶提取物各剂量组内、外毛细胞形态均有所改善，存活数均提高（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗毛细胞形态和存活数的影响（×200，±s，n＝9）Fig.3 Effects of G.biloba extract on morphology and survival number of cochlear hair cells in presbycusis rat models （×200，±s，n＝9）

3.4 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗毛细胞超微结构的影响 对照组大鼠耳蜗毛细胞的超微结构正常，自噬小体数量较多，胞浆内线粒体、高尔基体、内质网等细胞器结构均完整，密度均一； 与对照组比较，模型组毛细胞超微结构严重破坏，自噬小体数量减少（P＜0.01），胞浆内线粒体密度降低，出现空泡样变，并且高尔基体、内质网等细胞器溶解、消失； 与模型组比较，银杏叶提取物低剂量组变化不明显，中、高剂量组毛细胞超微结构逐渐改善，自噬小体数量逐渐增多（P＜0.05，P＜0.01），胞浆内线粒体等细胞器结构改善，见图4。

图4 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗毛细胞超微结构的影响（±s，n＝9）Fig.4 Effects of G.biloba extract on ultrastructure of cochlear hair cells in presbycusis rat models （±s，n＝9）

3.5 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗组织Beclin1、LC3、P62 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠耳蜗组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均降低（P＜0.01），P62 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，银杏叶提取物各剂量组大鼠耳蜗组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高（P＜0.05，P＜0.01），P62蛋白表达降低（P＜0.01），见图5。

图5 银杏叶提取物对老年性聋大鼠耳蜗组织Beclin1、LC3、P62 蛋白表达的影响（±s，n＝9）Fig.5 Effects of G.biloba extract on protein expressions of Beclin1，LC3 and P62 in cochlea of presbycusis rat models（±s，n＝9）

4 讨论

老年性聋是由耳蜗和听觉中枢的年龄相关性退化引起的，其病理因素与耳蜗细胞的变性密切相关［7］。随着机体老化，毛细胞及血管纹变性，可能引起螺旋神经节细胞损伤，进而导致听力减退［8］。到目前为止，老年性聋的发病机制尚不完全清楚，耳蜗细胞自噬功能异常可能是老年性聋主要发病机制之一［9-11］。衰老耳蜗中，自噬功能障碍，导致耳蜗细胞受损，听功能减退［12］。因此，寻求有效提高自噬功能的药物，可能对减轻耳蜗细胞变性，延缓听力损失有重要意义。

银杏叶提取物对多种内耳疾病有较好的临床疗效［13-14］。袁海虹等［15］发现，银杏叶提取物可通过提高自噬功能，上调视网膜缺血-再灌注损伤后细胞存活率。近期，郭涛等［16］发现，银杏叶提取物可上调自噬功能来缓解脑卒中。鉴于此，本课题组推测银杏叶提取物可能是通过调控自噬水平来延缓听觉细胞衰老的。本研究采用ABR 来检测老年性聋听阈的变化发现，与对照组比较，模型组大鼠不同频率ABR 阈值均提高； 经不同剂量银杏叶提取物给药后，ABR 阈值均降低，表明银杏叶提取物可改善老年性聋大鼠的听阈。本研究病理结果与既往研究相吻合［17］。对照组大鼠毛细胞、血管纹、螺旋神经节细胞等形态正常； 与对照组比较，模型组大鼠毛细胞、血管纹、螺旋神经节细胞等损伤；经银杏叶提取物干预后，以上细胞的形态改善。免疫荧光染色结果发现，与对照组比较，模型组内、外毛细胞存活数降低； 经不同剂量银杏叶提取物干预后，内、外毛细胞存活数均提高。

Beclin1、LC3、P62 均是自噬过程中的关键标志物，常用于评估自噬的活性程度［18］。Yuan等［19］研究表明，与青年大鼠比较，老年大鼠听皮层的自噬流受阻，LC3 和Beclin1 蛋白表达降低，导致老化大鼠听力损失。He 等［20］研究发现，新霉素导致耳蜗毛细胞中Beclin1 和LC3 表达降低，P62 大量聚集，诱导毛细胞损伤。为了进一步探讨银杏叶提取物是否通过调控耳蜗细胞自噬对老年性聋发挥保护作用，本研究观察了耳蜗毛细胞自噬小体并检测了Beclin1、LC3、P62 蛋白表达情况。结果发现，与对照组比较，模型组大鼠耳蜗毛细胞中自噬小体数量减少，耳蜗组织中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，P62 蛋白表达升高； 而经不同剂量银杏叶提取物干预后，自噬小体数量逐渐增加，Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62 蛋白表达降低。

综上所述，自噬是探索老年性聋发病机制的新视角，老年性聋大鼠耳蜗组织的自噬水平降低，而银杏叶提取物可修复受损的耳蜗细胞形态，延缓听觉细胞的衰老，改善老年性聋大鼠的听功能，其机制可能与调控耳蜗组织中Beclin1、LC3Ⅱ和p62 蛋白表达，上调自噬有关。