沉默信息调节因子2在胆管癌中的表达及其对可切除胆管癌患者预后的预测价值

王 威，季文斌，吕振宇，孙万亮，邵 玉，刘 静，杨 燕

1. 蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科，安徽 蚌埠 233004

2. 蚌埠医学院第一附属医院肝胆外科，安徽 蚌埠 233004

3. 蚌埠医学院第一附属医院国家药物临床试验机构，安徽 蚌埠 233004

胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的高度侵袭性恶性肿瘤，近年来总体发病率不断攀升。虽然胆管癌的治疗已经取得了一些进展，但患者整体存活率仍然较低，一个重要原因是胆管癌早期临床特征不明显，仅三分之一的患者可以通过手术治疗，术后患者5年存活率为25%~40%［1］，而大多数患者确诊时往往处于不可手术的晚期阶段，治疗选择十分有限，5年存活率低于20%［2］。更重要的是，胆管癌缺乏敏感有效的预后生物标志物或者预后预测模型，这些使得胆管癌患者的后续治疗及疾病管理变得困难。因此，探索胆管癌诊疗靶点及预后预测工具具有重要意义。

SIRT2 是依赖NAD+的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，主要定位于细胞质，可调控代谢和基因表达等多种生物过程［3］。现有研究表明，SIRT2在不同恶性肿瘤中的表达存在差异，在卵巢癌、前列腺癌等肿瘤组织中，SIRT2的表达显著低于正常组织；而在黑色素瘤、胃癌等肿瘤组织中，SIRT2 的表达高于正常组织［4］，这提示SIRT2可能既具有促瘤作用，又具有抑瘤作用。另外值得注意的是，在乳腺癌早期癌变过程中SIRT2 具有显著的肿瘤抑制作用，而在晚期阶段，其过表达则预示着肿瘤高侵袭性，抑制SIRT2 具有抗癌效应［5］。此外，Li等［6］发现SIRT2 mRNA和蛋白水平在非小细胞肺癌中均显著下调，而Luo 等［7］观察到SIRT2在非小细胞肺癌中表达显著升高。这表明SIRT2在恶性肿瘤中的作用是复杂的且存在争议。在胆管癌中，SIRT2 被发现存在显著过表达，并可能通过诱导代谢重编程［8］及调控乙酰化P53 水平［9］促进胆管癌细胞增殖、侵袭。鉴于SIRT2 在肿瘤中的复杂性及争议性，本研究拟对SIRT2 在胆管癌中的价值进行进一步探究，并为探寻胆管癌术后生存预测模型增添新的数据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

从TCGA 下载胆管癌数据集，从GEO 下载GSE107943 转录组数据，提取SIRT2mRNA 的表达量。TCGA数据集含有36个胆管癌组织，其中有配对正常胆管组织的9个；GSE107943数据集含有30个胆管癌组织，其中有配对正常胆管组织的27个。

收集2016年1月1日至2021年12月31日在蚌埠医学院第一附属医院经手术治疗且经术后病理检查确诊为胆管癌患者的蜡块标本或组织标本。患者纳入标准：①经手术治疗且术后病理确诊为胆管癌；②术前未进行任何抗肿瘤治疗；③重要临床病理资料完整且可被追溯。排除标准：①多发癌，继发性胆道系统恶性肿瘤；②组织标本封存不佳。根据纳入和排除标准，共收集到89例术后胆管癌患者的标本，其中有配对癌旁组织的44 例。本研究通过蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会审查（BYYFY-2018KY46）。收集89 例胆管癌患者的临床病理特征，包括年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤数、脉管侵犯情况、淋巴结转移情况、神经侵犯情况、分化程度，临床分期等，还有部分常见实验室指标如糖类抗原199、癌胚抗原、总胆红素、总胆固醇、三酰甘油等。患者随访时间截至2022年6月1日，通过患者医院病历系统的个人就诊记录或电话随访获得生存信息，记录所有患者的总生存期，即手术日直至患者发生因为任何原因死亡的时间。

1.2 免疫组织化学染色检测SIRT2表达

将组织块进行包埋、切片（4 µm 厚）、烘烤（75 ℃，6 h）后，按照脱蜡、梯度乙醇水化、修复、内源性过氧化物酶阻断、封闭、抗原抗体反应、DAB 显色、苏木精复染、梯度乙醇脱水、透明、中性树胶封片等步骤进行免疫组织化学染色，其中SIRT2 一抗（德国Gene Tex 公司）稀释比例为1∶200。由两位病理学专家利用光学显微镜对标本染色结果进行盲评，并取平均值作为最后得分。每个切片随机选择5 个高倍镜视野（200×），以肿瘤细胞或癌旁组织细胞胞质内出现棕黄色颗粒为SIRT2 染色阳性。染色信号强度评分：无染色为0 分（阴性），淡黄色为1 分（弱，+），黄褐色为2 分（中等，++），褐色为3 分（强，+++）；染色阳性程度根据阳性细胞数的百分比评分：0%~25%为1 分，>25%~50%为2 分，>50%~75%为3 分，>75%为4 分。根据阳性细胞染色强度以及细胞数占比的乘积进行最终评分，评分范围0~12，以中位数6 分作为截断值［10］，评分小于6 分为低表达组，大于等于6分为高表达组。

1.3 基因集富集分析及SIRT2关联基因分析

利用R“clusterProfiler”包进行基因集富集分析，并绘制富集结果图（校正后的P<0.05、FDR<0.25和|NES|>1 认为是显著富集）。使用LinkedOmics数据库（http：//www.linkedomics.org/login.php）探索胆管癌中SIRT2关联基因。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0、R（3.6.3）及EXCL-VLOOKUP函数对数据进行处理，组间比较采用t检验，采用配对样本t检验进行配对差异分析，率的比较采用χ2检验或Fisher 精确检验；使用Kaplan-Meier生存曲线、Log-Rank检验及COX 回归分析进行生存分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。根据COX 回归结果建立列线图，R“rms”包、“survival”包进行列线图可视化，R“timeROC”包进行时间依赖性ROC曲线数据分析，R“ggplot2”包绘制曲线。

2 结 果

2.1 SIRT2在胆管癌组织中表达变化

TCGA 数据库分析结果显示，SIRT2mRNA 在胆管癌组织中较癌旁组织表达显著增高（均P<0.05），见图1A、B。使用GSE107943 数据集进行验证，结果进一步证实了无论非配对组织差异分析，还是配对组织差异分析，SIRT2mRNA 在胆管癌组织中均存在高表达（图1C、D）。研究者队列免疫组织化学染色分析结果显示，SIRT2 阳性颗粒主要定位在细胞质中，多呈淡黄色或棕黄色（图2）；无论基于非配对组织差异比较，还是配对组织差异分析，结果均显示SIRT2 在胆管癌组织中的表达较癌旁组织显著增高（图1E、F）。以上结果提示，SIRT2在胆管癌中存在高表达。

图1 胆管癌组织与正常组织中SIRT2 mRNA和蛋白表达比较Figure 1 Expression of SIRT2 mRNA and protein in cholangiocarcinoma tissues and normal tissues

图2 两个代表性胆管癌标本及其配对癌旁组织中SIRT2的表达情况Figure 2 SIRT2 expression in two representative cholangiocarcinoma samples and their paired adjacent non-cancerous tissues

2.2 胆管癌组织中基因集富集分析及SIRT2 关联基因分析结果

SIRT2 高表达患者胆管癌组织中核糖体、氧化磷酸化、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、丙酮酸代谢等途径显著富集（图3），提示SIRT2 高表达可能参与调控胆管癌患者肿瘤组织代谢。进一步基于LinkedOmics 数据库分析得到SIRT2 正负相关的蛋白，正相关分子包括ATG4A、SMPD1、NFKBIB等（图4A），负相关分子包括ZNF624、SMARCC1、ACVR2B等（图4B）。

图3 胆管癌组织中SIRT2高表达的主要基因集富集分析结果Figure 3 Main results of gene set enrichment analysis in cholangiocarcinomain with up-regulated SIRT2

图4 胆管癌组织中SIRT2关联分子热图Figure 4 Heat map of SIRT2-associated molecules in cholangiocarcinoma

2.3 SIRT2 表达与胆管癌患者临床病理特征的关系

针对胆管癌患者的研究者队列数据分析发现，SIRT2 表达与胆管癌患者术前血三酰甘油水平、淋巴结是否转移和肿瘤大小显著相关（均P<0.05），表现为SIRT2 低表达患者更易出现高甘油三酯血症，SIRT2 高表达患者更易出现淋巴结转移和负荷更大的肿瘤。见表1。

表1 SIRT2表达与胆管癌患者临床病理特征的关系Table 1 The relationship between SIRT2 expression level and the clinicopathological characteristics in patients with cholangiocarcinoma[n(%)]

2.4 SIRT2 表达与胆管癌患者术后总生存期的关系

89 例胆管癌手术患者中位总生存期为23 个月。Kaplan-Meier 生存分析提示，SIRT2 高表达组总生存期较低表达组明显缩短（分别为21 和29 个月，HR=1.71，95%CI：1.06~2.77，P<0.05），见图5。结果提示SIRT2 表达与胆管癌患者术后总生存期相关。

图5 基于研究者队列SIRT2高、低表达组胆管癌患者Kaplan-Meier生存曲线Figure 5 Kaplan-Meier survival curves in high and low SIRT2 expression groups based on the study cohort

2.5 影响胆管癌患者术后总生存期的单因素和多因素COX回归分析

单因素COX 回归分析结果显示，组织分化程度（HR=1.981，95%CI：1.181~3.323，P<0.05）、TNM分期（HR=2.521，95%CI：1.392~4.566，P<0.01）、是否接受后续治疗（HR=0.586，95%CI：0.351~0.977，P<0.05）及SIRT2 表达（HR=1.897，95%CI：1.127~3.193，P<0.05）与胆管癌术后患者总生存期显著相关（表2）；多因素COX回归分析结果显示，TNM分期（HR=2.100，95%CI：1.129~3.904，P<0.05）和SIRT2 表达（HR=1.726，95%CI：1.102~2.944，P<0.05）是胆管癌术后患者总生存期的独立预测因素（表3）。

表2 影响胆管癌患者预后的单因素回归分析结果Table 2 Univariate regression analysis results of prognostic factors in patients with cholangiocarcinoma

表3 影响胆管癌患者预后的多因素回归分析结果Table 3 Multivariate regression analysis results of prognostic factors in patients with cholangiocarcinoma

2.6 胆管癌术后患者预后列线图模型的构建及验证

根据上述COX 回归分析得出的影响胆管癌术后患者预后的因素，并结合有意义的重要临床病理参数构建列线图模型（图6），预测模型显示得分越高的患者，所对应的预后越差。利用校准曲线验证该预测模型的性能，发现与参考曲线拟合度较高，C 指数=0.675（0.638~0.712）（图7）。列线图模型、AJCC 第八版TNM 分期系统预测胆管癌患者1、2、3年存活的ROC 曲线显示，列线图模型预测患者1、2、3年预后的AUC 分别为0.879、0.778、0.953，AJCC 第八版TNM 分期系统预测患者1、2、3年预后的AUC分别为0.745、0.621、0.612（图8），提示该模型预测胆管癌术后患者生存较传统TNM分期效能更佳。

图6 基于研究者队列胆管癌患者预后因素构建的列线图模型Figure 6 Prognostic nomogram of cholangiocarcinoma patients based on the study cohort

图7 列线图模型用于预测胆管癌患者术后总存活率的校准曲线Figure 7 Calibration plots of the developed nomogram model for predicting overall survival rate of postoperative patients with cholangiocarcinoma

图8 列线图模型及TNM 分期系统预测胆管癌患者术后预后情况的ROC曲线Figure 8 Receiver operating characteristic curves for predicting the postoperative prognosis of patients with cholangiocarcinoma using nomogram model and TNM staging system

3 讨 论

SIRT2 是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，其表达异常与包括肿瘤在内的多种疾病有关［11］。本研究通过TCGA、GEO 公共数据库组学数据及研究者队列免疫组织化学染色结果综合分析表明，胆管癌患者肿瘤组织中SIRT2 表达较癌旁组织显著增高。这一结果与既往关于SIRT2在胆管癌中的初步探索结果一致［8］，证实了SIRT2 在胆管癌中显著过表达，提示SIRT2 高表达可能促进了胆管癌的发生。

研究发现，SIRT2可以通过去乙酰化不同的内源性底物，参与糖、脂代谢等生物学功能的调节［12］。在胆管癌中，Xu等［8］发现SIRT2/cMYC诱导的代谢重编程可以促进细胞增殖和抑制凋亡；王平安［9］发现，SIRT2可能通过调控乙酰化P53水平影响肝内胆管癌肿瘤细胞的增殖和侵袭。本研究通过基因集富集分析发现，SIRT2高表达显著富集多种代谢相关通路，如核糖体、脂肪酸代谢、氧化磷酸化、氨基酸代谢、丙酮酸代谢等。众所周知，肿瘤细胞在癌症发生发展过程中可以通过代谢重编程赋予肿瘤细胞存活和增殖的能力。如癌细胞会通过“Warburg效应”促进糖酵解，从而提供肿瘤增殖所需的养分及能量［13］。此外，研究发现某些脂肪酸和氨基酸如谷氨酰胺、丝氨酸和甘氨酸是促进癌细胞生长的代谢调节剂［14-15］。结合现有研究及本文生物信息学分析结果，推测SIRT2 可能在胆管癌中通过调控糖、脂质、氨基酸等物质的异常代谢促进肿瘤的发生发展，这值得进一步研究。

本研究临床病理特征分析提示，SIRT2 的表达与患者术前血三酰甘油水平、淋巴结是否转移和肿瘤大小存在相关性。既往研究发现，SIRT2 表达与肿瘤分化程度、肿瘤大小存在关联［8］，本研究结果与其部分一致，共同提示SIRT2可能与胆管癌患者某些恶性表型相关。针对SIRT2 表达与胆管癌患者血清三酰甘油水平的关系，与基因集富集分析结果部分相符，进一步佐证了SIRT2 可能参与了胆管癌患者的脂质代谢紊乱调控。本研究基于大数据分析得到了SIRT2 的关联分子，为后续SIRT2 的深入机制研究提供了方向。

本研究分析了SIRT2 表达与胆管癌术后患者预后的相关性。国外一项最新研究报道了1124 例切缘阴性的胆管癌患者中位总生存期为45.1个月［16］。本研究纳入的89例胆管癌患者中位总生存期为23个月，较前者总生存期短，可能与本研究纳入胆管癌患者病例数较少、样本特点不同以及国内外疾病的综合管理差异有关。与此同时，国内一项研究报道胆管癌患者术后中位总生存期为13个月［17］，与本研究相比较低，可能原因是该研究纳入人群时间跨度较大（2013—2021年），而近些年国内胆管癌的治疗有所发展。研究发现，SIRT2高表达的胆管癌患者预后较SIRT2低表达患者差，这与Xu 等［8］的研究一致，共同揭示了SIRT2在胆管癌患者中的预后预测价值。基于研究者队列的胆管癌患者预后单因素COX回归分析表明，TNM分期、SIRT2表达、肿瘤分化程度、是否接受后续治疗与胆管癌患者生存相关，多因素COX回归分析结果提示SIRT2表达和TNM分期是术后胆管癌患者生存的独立预测因素。可见，无论从单因素还是多因素COX分析结果来看，SIRT2均有预测胆管癌术后患者预后的重要价值。探寻有效的生存预测模型对于胆管癌风险预测、疾病分层管理以及改善预后尤为重要。因此，本研究最后基于SIRT2 构建了一个新型列线图预后模型，并且该模型被证实有较好的预测准确性，可能较AJCC第八版TNM 分期系统预测效能更佳。但本研究仍存在部分不足：①本研究数据基于生物信息学分析及单中心队列研究，实验结果在推广前仍需进一步验证；②本研究纳入人群为胆管癌患者，尚未对亚类进行细分，因此结果的广泛适用性存在一定局限；③本研究虽然揭示了SIRT2 在胆管癌中的预后价值并基于生物信息学分析初探了其可能的作用机制，但具体分子机制仍有待设计精良的体内外研究进一步揭示。

综上所述，本研究通过公共数据库及研究者队列数据揭示了SIRT2在胆管癌中的表达及临床价值，并基于SIRT2构建了有效生存预测模型，研究不仅丰富了胆管癌发病机制研究，也为临床医生更好地管理该类疾病患者提供新的预后预测工具。

志谢研究得到安徽省教育厅高校自然科学研究重大项目（2023AH040291）、安徽省高校优秀青年人才支持计划（gxyq2022042）、蚌埠医学院“512人才培育计划”（by51202 208）支持

AcknowledgementsThis study was supported by the Natural Science Research Major Project of Universities of Anhui Province (2023AH040291), Excellent Youth Talents Support Program in Higher Education Institutions of Anhui Province (gxyq2022042), and 512 Talent Cultivation Plan of Bengbu Medical College (by51202208)

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

©The author(s) 2024. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)