测定地克珠利混悬液中的聚山梨酯20含量和枸橼酸含量的方法

李 芳,孙立亚,杨丽英

(百美达医药科技(北京)有限公司,石家庄 050000)

1 材料和方法

1.1 材料 Thermo U3000高效液相色谱仪;Allchrom ELSD6000蒸发光检测器;METTLER TOLEDO XSE205分析天平;METTLER TOLEDO SE400-K pH计。

乙腈(色谱纯,Merck);甲醇(色谱纯,Merck)Polysorbate 20 (分析纯CRODA);枸橼酸(中国食品药品检定研究院,100396-202104);磷酸氢二钠(科密欧,20190801);磷酸:(科密欧,20170510);方法开发和验证所用的地克珠利混悬液有百美达医药科技(北京)有限公司研发提供(批号为RDSB2009-07、RDSB2009-08、RDSB2010-01)

1.2 方法

1.2.1 色谱条件: 试验选取了Thermo Acclaim surfactant plus 4.6 mm×250 mm,5 μm和 Thermo Accucore C18 4.6 mm×100 mm, 2.6 μm两根色谱柱进行试验,两者对吐温20 均有较好的保留,且理论塔板数均良好,通过重复性进行,后者的重复性明显优于前者,故选定Thermo Accucore C18 4.6 mm×100 mm, 2.6 μm 为本方法使用的色谱柱(图1)。

图1 HPLC 色谱图Fig 1 HPLC Chromatogram

优化后的聚山梨酯20的色谱条件:色谱柱:Thermo Accucore C18 4.6 mm×100 mm, 2.6 μm。HPLC: Thermo U3000。流速:0.5 mL/min。流动相A:水,流动相B:乙腈

梯度程序如下:

时间/minA/%B/%0-39554-840608-20208020.1-30955

检测器:ELSD6000(Allchrom),漂移管温度:115 ℃。气体流速:2L/min,稀释剂:乙腈。

枸橼酸的色谱条件:色谱柱:Tech Mate ST C18 250 mm×4.6 mm, 5 μm,流动相:A;20 mmol 磷酸氢二钠 (用磷酸调节pH至3.0)B:色谱甲醇。流动相A∶B=95∶5。流速:1.0 mL/min,柱温:30 ℃ 紫外检测波长:UV 210 nm。

观察组患者的脑出血治疗效果明显优于对照组,差异显著(P<0.05),详细数据见表1;同时观察组患者的血肿扩大率5.3%明显低于对照组19.3%,差异显著(P<0.05)。

1.2.2 溶液配制 吐温20的溶液配制:

对照品的制备:取吐温20对照品约0.33 g,精密称定,置于200 mL量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀。精密量取1 mL,置于10 mL量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀。

供试品的制备:精密量取2.5 mL样品,置于10 mL量瓶中,加乙腈溶解并稀释至刻度。

阴性样品的制备:按样品的配方比例取不含吐温20的空白制剂(含处方中主成分及其他所有辅料)约2.5 mL,置于10 mL量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀。

枸橼酸的溶液配制:

对照品的制备:取枸橼酸对照品约50 mg,精密称定,置于25 mL量瓶中,加枸橼酸色谱条件下流动相稀释至刻度,摇匀。精密量取1 mL,置于10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。

供试品的制备:精密量取2 mL样品,精密称定,置于10 mL量瓶中,加枸橼酸色谱条件下流动相溶解并稀释至刻度。转移适当体积到离心管,离心机速度13000 rpm,离心10 min。用0.45 μm滤膜过滤既得。

阴性样品的制备:按样品的配方比例取不含枸橼酸的空白制剂(含处方中主成分及其他所有辅料)精密量取2 mL样品,精密称定,置于10 mL量瓶中,加枸橼酸色谱条件下流动相溶解并稀释至刻度。转移适当体积到离心管,离心机速度13000 rpm,离心10 min。用0.45 μm滤膜过滤既得。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验 精密移取聚山梨酯20对照品溶液,相当于聚山梨酯20浓度为0.165 mg/mL的溶液。连续进样5针,记录色谱峰保留时间,理论塔板数、吐温20及其相邻峰的分离度和吐温20的峰面积,并计算其RSD。实验结果显示,吐温20色谱峰的保留时间及峰面积的RSD<2.0%,理论塔板数>2000,聚山梨酯20和其相邻峰的分离度>1.5,满足HPLC和ELSD方法要求。

精密移取枸橼酸对照品溶液,相当于枸橼酸浓度为0.2 mg/mL的溶液。连续进样5针,记录色谱峰保留时间,理论塔板数、枸橼酸及其相邻峰的分离度,和枸橼酸的峰面积,并计算其RSD。实验结果显示,枸橼酸色谱峰的保留时间及峰面积的RSD<2.0%,理论塔板数>2000,枸橼酸和其相邻峰的分离度>1.5,满足HPLC方法要求。

2.2 专属性试验 对聚山梨酯对照品、阴性样品及样品进行检测(图2),可以清楚的看到,此条件下样品中的聚山梨酯20与其他组分能达到很好的分离,而且没有干扰,专属性符合要求。对枸橼酸对照品、阴性样品及样品进行检测(图2),可以清楚的看到,此条件下样品中的枸橼酸与其他组分能达到很好的分离,而且没有干扰,专属性符合要求。

图2 液相色谱图Fig 2 HPLC Chromatogram

2.3 线性试验 精密移取聚山梨酯20对照品溶液适量,相当于聚山梨酯20浓度为0.165 mg/mL的溶液。分别进样5、10、15、20、30 μL,得到lg(聚山梨酯20的量)与lg(聚山梨酯峰面积)的线性方程为:y=1.67x+0.3212,R2=0.9984。标准曲线的R2>0.99,符合HPLC和ELSD方法要求。

表1 线性结果Tab 1 Linear results

精密移取枸橼酸对照品溶液适量,储备液浓度相当于枸橼酸浓度为2 mg/mL的溶液。分别制备相当于标准对照品溶液50%,70%,80%,100%,120%,150%的线性溶液,得到枸橼酸的线性方程为:y=0.0796x-0.0015,R2=1。标准曲线的R2>0.999,符合HPLC方法要求。

2.4 精密度试验 按照“1.1.2.2”项下溶液配制方法,同时配制6份聚山梨酯20供试品溶液,计算RSD。实验结果显示,重复性试验中,RSD为1.9%,小于3.0%,符合规定。

按照“1.1.2.2”项下溶液配制方法,同时配制6份枸橼酸供试品溶液,计算RSD。实验结果显示,重复性试验中,RSD为0.51%,小于2.0%,符合规定。

表2 精密度结果Tab 2 Precision results

2.5 回收率试验 按照“1.1.2.2”项下供试品溶液配制方法,分别配制聚山梨酯20浓度为0.132,0.165,0.198 mg/mL的溶液各三份。相当于80%,100%,120%三个浓度水平的样品溶液,计算每个样品中聚山梨酯20的含量,计算回收率。结果分别为101.2%,99.4%,99.8%。回收率良好,符合规定。

按照“1.1.2.2”项下供试品溶液配制方法,分别配制枸橼酸浓度为0.16,0.20,0.24 mg/mL的溶液各三份。相当于80%,100%,120%三个浓度水平的样品溶液,计算每个样品中枸橼酸的含量,计算回收率。结果分别为100.31%,99.94%,98.56%。回收率良好,符合规定。

表3 回收率结果Tab 3 Recovery result

3 结 论

本文介绍了测定地克珠利混悬液中的聚山梨酯20和枸橼酸的含量的检测方法,能够使用此方法测定混悬液中重要成分,在控制主要原料成分含量的条件下,准确控制表面活性剂聚山梨酯20及絮凝剂反絮凝剂枸橼酸的含量,保证制剂的稳定性,同时保障动物用药的安全性。所有方法经过验证,有较好的精密度,线性及回收率等验证结果,该方法可以实现准确的定量分析,操作简单,使用方便,节约检测时间,本文所述的方法可作为一个可靠的检测方法。