科罗索酸抑制人卵巢癌细胞SKOV-3 过度增殖和诱导细胞凋亡

孙喆 ,王钧峰 ,李会影 ,姚慧欣

牡丹江医学院附属红旗医院1妇产科,2骨科,3医务科 黑龙江省牡丹江市,157011

卵巢癌是最为致命的妇科癌症之一,确诊后不到一半的患者可以在5 年内存活下来。由于早期症状难以觉察,大部分患者诊断出卵巢癌时已经进入晚期,癌细胞转移到其他组织中,通常腹腔转移最为多见[1-2]。当前卵巢癌的治疗主要是通过手术切除肿瘤和铂/紫杉醇联合化疗,虽然80 %的患者能取得良好效果,然而癌症的复发率依然很高,70 %的患者在5 年内复发并产生了抗药性[3]。因此,寻找新的治疗手段和药物,改善目前的治疗效果是必要的。

在过去的数十年中,来源于药用植物的天然提取物由于其安全性和良好的功效而受到临床研究者的青睐,尤其在癌症的治疗当中,至少40 %的抗癌药物来源于天然产物[4]。科罗索酸 (corosolic acid,CRA) 是一种五环三萜类天然提取物,可从大花紫薇、枇杷、山楂等植物中提取获得,研究表明CRA 具有抗癌的能力,然而其分子机制十分复杂,至今仍有很多尚待阐明的地方[5]。本研究通过培养人卵巢癌SKOV-3 细胞,用CRA 处理细胞,旨在探究了CRA 对卵巢癌细胞SKOV-3 的抑制增殖和诱导凋亡的作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

CRA 购自Sigma 公司,RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自美国Invitrogen 公司,青霉素、链霉素、CCK-8 试剂盒、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、免疫组化试剂盒、Ecl显色液购自北京索莱宝生物公司,GAPDH、抗原Ki67 (Ki67)、周期蛋白D1 (cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinases 6,CDK6)、B 细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、活化型半胱天冬酶3 (cleaved caspase-3)、cleaved caspase-9、磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B (protein kinase B,AKT)、p-AKT、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 抗体购自英国Abcam 公司。

1.2 细胞培养及分组处理

人卵巢癌细胞SKOV-3 购自美国ATCC 公司,培养于含有10 % 胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)、100 单位青-链霉素的RPMI-1640 培养基中,培养箱条件为5 % CO237 ℃。将细胞分为空白对照(Ctrl)、CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组,除Ctrl 组外,每组分别定容至对应浓度的CRA 进行处理。

1.3 CCK-8 检测细胞增殖

将处理后的细胞继续在5 % CO2,37 ℃环境条件下培养,每隔1 天使用CCK-8 法测定细胞增殖倍数,持续4 d。测定时将细胞接种于96 孔板,5 % CO2,37 ℃环境下预培养24 h,在培养板里加入10 μL/孔的CCK-8 溶液继续培养4 h,使用酶标仪检测450 nm 吸光度。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

用不含EDTA 的胰蛋白酶将细胞消化成单细胞,并用冰的PBS 洗涤2 次。根据制造商的说明,使用细胞凋亡检测试剂盒进行Annexin V 染色。在4 ℃暗室中孵育15 min 后,加入PI 染色液,轻轻混合,4 ℃孵育5 min,用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.5 蛋白质印迹检测蛋白表达

收集细胞并裂解在RIPA 裂解液中,使用BCA蛋白测定试剂盒测量各组细胞蛋白浓度。根据测定浓度,每组40 μg 的蛋白质样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行,并转移到硝化纤维膜上。将膜在4 ℃的5 %脱脂乳中孵育8 h,并与一抗反应过夜。随后,将它们暴露于过氧化物酶偶联的二抗1 h。最后,使用增强化学发光检测试剂盒进行条带检测。

1.6 裸鼠皮下移植瘤模型建立

40 只鼠龄6～8 周,体重18～20 g 的SPF 雌性BALB/c 裸鼠购自牡丹江医学院,许可证号:SYXK (黑) 2019-006,在指定的动物房中饲养48 h,所接触的器具、水和食物均需无菌。本实验获牡丹江医学院附属红旗医院伦理审查委员会批准。将SKOV-3 细胞株以浓度1 ×106个/只经左腋皮下接种于裸鼠中。每隔1 天记录一次肿瘤体积,当肿瘤体积约为100 mm3时,将裸鼠分为Ctrl 组、CRA(10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组,每 组10 只,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组灌胃相应浓度的CRA,Ctrl 组灌胃生理盐水。所有裸鼠每天给药1 次,每隔7 天记录一次肿瘤体积,连续给药35 d 后处死裸鼠,取出肿瘤组织用于后续实验。

1.7 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC) 检测组织Ki67、VEGF 阳性细胞率

移植瘤样品在4 %甲醛中固定过夜,并用梯度浓度的乙醇脱水。将组织切成5 μm 厚的切片,然后将切片干燥、脱蜡,并用柠檬酸盐修复抗原15 min。切片用1 % BSA 封闭30 min,然后分别与Ki67,VEGF 一抗和用HRP 标记的二抗孵育。切片与DAB 显色液反应,并用苏木精复染,在光学显微镜下拍照获取图片进行后续分析。

1.8 统计学分析

本研究数据表示为平均值±标准差。所有的统计分析使用GraphPad Prism 5.0。采用单因素方差分析和t检验进行分析数据,以确定所有实验组之间的差异。

2 结果

2.1 CRA 抑制SKOV-3 细胞增殖

与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组SKOV-3 细胞增殖水平显著降低(P＜0.01),呈时间和浓度依赖性变化(图1)。与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组Ki67、Cyclin D1、CDK6 蛋白表达水平显著降低 (P＜0.01),且呈浓度依赖性变化(图2)。

图1 CRA 对SKOV-3 细胞增殖的影响(n=6)

图2 CRA 对细胞增殖标志蛋白表达的影响(n=6)

2.2 CRA 促进SKOV-3 细胞凋亡

与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组SKOV-3 细胞凋亡率显著升高(P＜0.01),呈浓度依赖性变化(图3)。

图3 CRA 对SKOV-3 细胞凋亡的影响(n=6)

与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组Bcl-2/Bax 比率显著降低,cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表达水平显著升高(P＜0.01),且呈浓度依赖性变化(图4)。

图4 CRA 对凋亡相关蛋白表达的影响(n=6)

图5 CRA 对PI3K/AKT 信号通路的调控作用(n=6)

2.3 CRA 对PI3K/AKT 信号通路的抑制作用

与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组PI3K/AKT 信号通路关键蛋白PI3K 表达水平和p-AKT/AKT 比率显著降低(P＜0.01),且呈浓度依赖性变化(图 5)。

2.4 CRA 抑制皮下移植瘤组织生长

与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组肿瘤体积显著受到抑制 (P＜0.01),呈时间和剂量依赖性变化(图6);同时,与Ctrl 组比较,CRA (10 μmol/L)、CRA (20 μmol/L)、CRA (50 μmol/L) 组Ki67、VEGF 阳性细胞率显著降低(P＜0.01),且呈剂量依赖性变化(图7)。

图6 CRA 对皮下移植瘤组织生长的影响(n=6)

图7 CRA 对Ki67 和VEGF 表达的影响(n=6,×200)

3 讨论

CRA 具有非常广泛的药用价值,在抗高血糖、抗高血脂、抗氧化和消炎上均发挥着作用[6]。在抗癌方面,CRA 在诸如胃癌、肝癌和前列腺癌等癌症中均具有显著的抗癌作用,并有着不一样的作用机制[7-9]。在Fujiwara 等[10]的研究中,通过细胞增殖和毒理检测,确立CRA 在30 μmol/L 左右时可显著抑制卵巢癌细胞的增殖。本研究发现CRA可显著抑制SKOV-3 细胞的增殖,并且呈浓度依赖性变化关系。与之前研究不同,本研究中10 μmol/L 的CRA 就表现出显著的增殖抑制作用,这种差异可能与细胞生长环境以及检测方法不同有关。同时,本研究对增殖相关蛋白Ki67、Cyclin D1、CDK6 表达水平进行了检测,发现CRA 可抑制Ki67、Cyclin D1 和CDK6 的表达。Ki67 是一种与细胞增殖紧密相关的核蛋白,近年来被认为是一种与化疗敏感性和肿瘤复发相关的重要诊断因子[11]。Cyclin D1 是一种调控细胞周期的原癌基因,其过度表达会缩短G1/S 转换时间,在多种癌症中均发现了Cyclin D1 的过度表达,致细胞增殖失控而恶性化[12]。CDK6 是一个关键细胞周期促进因子,参与到多种肿瘤细胞的增殖过程中[13]。本研究通过构建皮下移植瘤模型,发现CRA 可显著抑制裸鼠体内的卵巢癌肿瘤组织生长,并降低肿瘤组织中Ki67 和VEGF 的表达,VEGF 在肿瘤中诱导血管增生[14]。这些结果表明CRA 可显著抑制SKOV-3 细胞及组织的过度增殖。

为了进一步探究CRA 对SKOV-3 细胞的生长调控作用,本研究对其细胞凋亡水平进行了检测,结果表明CRA 可显著增加SKOV-3 细胞凋亡率。同时,CRA 可降低Bcl-2/Bax 比率,提高cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 蛋白表达水平,抗凋亡基因Bcl-2 和促凋亡基因Bax是一对重要的正负调控因子,Bcl-2 可阻止Bax 形成同源二聚体促进凋亡发生[15]。cleaved caspase-9 参与了内源性凋亡途径的起始,cleaved caspase-3 是细胞凋亡的主要效应因子[16]。结合实验结果表明CRA 可诱导SKOV-3 细胞凋亡。

PI3K/AKT 信号通路在细胞生存、细胞周期、细胞增殖等方面均发挥着重要的作用,其异常激活常与包括卵巢癌在内的各种癌症有关[17]。PI3K 可将PIP2 磷酸化为PIP3,并在膜上积累,从而激活下游的AKT 蛋白[18],激活的AKT 可磷酸化下游多种靶蛋白,从而促进肿瘤的发生、增殖与生存[19]。本研究发现CRA 可抑制PI3K 的蛋白表达,并降低p-AKT/AKT 的比率,表明CRP 可通过抑制PI3K/AKT 信号通路抑制SKOV-3 细胞的增殖并诱导其凋亡。

综上所述,CRA 可抑制卵巢癌细胞增殖相,并降低Bcl-2/Bax 比率,促进cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 表达,从而诱导细胞凋亡,其机制可能与PI3K/AKT 信号通路失活有关。同时,CRA 可在体内抑制裸鼠体内移植瘤的生长,这为卵巢癌的临床治疗提供了新的药物候选。下一步计划对CRA 在卵巢癌其他方面的作用作进一步探究。