木犀草素对D-半乳糖所致小鼠认知障碍的改善作用*

李斯盛，兰睿，谭淇，贾欣怡，熊炜，罗玥佶，曾杰

（长沙医学院，湖南 长沙 410219 ）

随着人口老龄化加剧，阿尔茨海默病的患病率逐渐增高，给老年人及其家庭带来精神痛苦和经济负担［1-2］，抗衰老，防痴呆，已成为医学界乃至整个社会的研究热点。衰老导致脑结构与功能的改变，表现为学习记忆能力的减退［1-3］，严重者甚至导致痴呆。衰老导致的认知障碍发病机制尚不清楚，研究表明神经炎症在其发病及进展中起重要作用。目前，西药治疗认知障碍存在许多问题，迫切需要寻找新的药物。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，具有抗感染、抗氧化等多种药理学特性，广泛应用于修复氧化应激损伤，抑制神经元凋亡等临床应用中［4-6］。本研究拟通过Morris 水迷宫实验、酶联免疫吸附测定（ELISA）等实验，观察木犀草素对D-半乳糖致衰老模型小鼠学习记忆能力的影响，为木犀草素用于临床改善学习记忆提供基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组及D-半乳糖皮下注射法建立衰老小鼠模型

购买的小鼠通过Morris 水迷宫的初次筛选，将筛选合格的30 只小鼠［湖南斯莱克景达动物有限公司，合格证号：SCXK（湘）2019-0004］适应性喂养3 d，分为3 组，每组10 只。分别是正常组、模型组、木犀草素（60 mg/kg）组。除正常组外，其它各组均颈后部皮下注射D-半乳糖（120 mg/kg）；同时灌胃给药，正常组、模型组给予生理盐水、木犀草素组每天按120 mg/kg 给药。实验结束前8 d 进行水迷宫行为学实验。

1.2 测定SOD、MDA 的活力

模型建立成功后，尾静脉取血，按试剂盒说明书，羟胺法测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）的活力、比色法测定血清中丙二醛（MDA）的活力。

1.3 免疫荧光染色

各组均随机选取6 只小鼠，腹腔注射（i.p.）给予水合氯醛40 mg/kg 深度麻醉。4%多聚甲醛灌注，取材海马，组织经脱水，透明，浸蜡制成蜡块，每组六张切片，按试剂盒添加相应抗体进行反应，应用荧光显微镜，在高倍显微镜下，观察NeuN 阳性细胞并拍照。

1.4 水迷宫检测

实验前1 d，让小鼠在水迷宫中自由游泳以适应环境。隐蔽平台实验：将平台置于第I 象限中央，训练时将小鼠从同一位置面向池壁放入水中，记录小鼠游泳的平均速度及逃避潜伏期，此实验在第1～4 日进行，实验时，小鼠入水点次序保持一致。空间探索实验：每天的隐蔽和反向实验结束后撤除平台，选取第Ⅱ象限为入水点，游泳时间为60 s，记录小鼠在原平台处的穿越次数，此实验在第2～7 日进行。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件统计分析数据。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间多重比较采用Post Hoc Tests 进行。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草素对衰老小鼠活动度和新事物分辨指数的影响

单因素方差分析显示，各组小鼠活动度差异无统计学意义（F=1.776,P＞0.05），各组间舔糖时间差异有统计学意义（F=18.25,P＜0.001），见图1。与正常组［（41.22±10.68）%］比较，模型组［（-4.282±16.34）%］小鼠的新事物辨别指数降低，差异有统计学意义（P＜0.001），木犀草素组［（18.43±21.67）%］小鼠的新事物分辨指数高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 木犀草素对衰老小鼠活动度和新事物分辨指数的影响

2.2 木犀草素对衰老小鼠学习记忆的影响

Morris 水迷宫探索结果如表1 所示。与正常组相比，模型组、木犀草素组小鼠潜伏期明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，木犀草素组小鼠潜伏期均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组小鼠在目标象限停留的时间比较差异有统计学意义（P＜0.05），与正常组比较，模型组小鼠在原平台处的穿越次数减少，差异有统计学意义（P＜0.05），木犀草素组停留时间高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 木犀草素对衰老小鼠学习记忆的影响（n=10,,s）

表1 木犀草素对衰老小鼠学习记忆的影响（n=10,,s）

注：1）与正常组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05。

2.3 木犀草素对衰老小鼠SOD、MDA 含量的影响

通过试剂盒检测各组小鼠海马组织中SOD、MDA 含量，结果显示与正常组比较，模型组SOD含量降低，MDA 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素组SOD 含量升高，MDA 含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 木犀草素对衰老小鼠SOD、MDA 含量的影响（n=10,）

表2 木犀草素对衰老小鼠SOD、MDA 含量的影响（n=10,）

注：1）与正常组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05。

2.4 木犀草素对各组小鼠NeuN 表达的影响

单因素方差分析显示，各组小鼠海马CA3 区NeuN 阳性细胞数比较差异有统计学意义（F=15.24，P＜0.001）。模型组小鼠NeuN 阳性细胞数目（170.70±22.34）明显少于正常组（234.70±35.93），差异有统计学意义（P＜0.05）；木犀草素组小鼠NeuN 阳性细胞数目（240.00±33.75）明显多于模型组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图2。

图2 木犀草素对衰老小鼠NeuN 阳性细胞数目的影响

2.5 木犀草素对小鼠海马突触蛋白的影响

WB 检测条带及分析如图3 所示。单因素方差分析表明各组小鼠突触核蛋白（Syn）的表达差异有统计学意义（F=5.98,P＜0.05），正常组小鼠Syn的表达相对值为（1.084±0.223），模型组小鼠Syn的表达（0.54±0.122）低于正常组，木犀草素组小鼠Syn 的表达（0.65±0.359）高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 木犀草素对小鼠海马突触蛋白的影响免疫印迹分析图

单因素方差分析表明各组小鼠突触后密度蛋白-95（PSD-95）的表达差异有统计学意义（F=7.684，P＜0.05），正常组小鼠PSD-95 的表达相对值为（1.003±0.348），模型组小鼠PSD-95 的表达（0.283±0.064）低于正常组，木犀草素组小鼠PSD-95 的表达（0.963±0.268）高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

阿尔茨海默病病因及机制复杂，病因学说主要有遗传控制说、自由基损伤说等［7-9］。其中，自由基损伤说是具有代表性的学说［10］。过剩的自由基会引发一系列毒性反应，加速各器官衰老的速度。基于这种机制的研究，最常用的模型是D-半乳糖导致的衰老动物模型，该模型与自然衰老较为相似［11］。本研究结果显示，D-半乳糖注射后，小鼠的运动能力并未明显改变，但是其新旧食物识别指数明显降低，表明该模型建立成功，D-半乳糖致衰老小鼠认知能力下降。进一步检测各组小鼠水迷宫实验，检测了小鼠找到平台的潜伏期和目标象限停留时间，发现D-半乳糖注射后延长了小鼠找到平台的潜伏期，降低了小鼠在目标象限的停留时间，提示D-半乳糖注射损害了小鼠学习记忆和空间探索能力，这与文献报道一致［12］。

SOD 和MDA 是反映机体氧化还原清除氧自由基能力的主要标志物［13］。本研究结果显示模型组小鼠SOD 含量降低，MDA 含量升高，提示模型组小鼠清除氧自由基能力下降。进一步检测表明模型组小鼠海马成熟神经元数目降低，突触相关蛋白表达下降，均提示D-半乳糖可能通过减弱氧自由基清除能力，导致神经元死亡，神经突触可塑性减弱，从而导致小鼠认知障碍。

目前，临床治疗阿尔茨海默病的一线药物主要是改善胆碱系统功能的药物和N-甲基-D-天氡氨酸（NMDA）受体拮抗剂。这些药物对治疗中、晚期阿尔茨海默病难见疗效，且有胃肠道及心血管方面的不良反应［14］。本研究表明，木犀草素能提高D-半乳糖致衰老模型小鼠新旧食物识别指数，减少定向航行潜伏期，增加探索能力，提示木犀草素能改善小鼠认知能力。进一步检测结果显示，木犀草素能增加衰老模型小鼠SOD 含量，降低MDA 含量，保护小鼠海马成熟神经元，并增加突触相关蛋白的表达。

综上所述，木犀草素可能通过增强氧自由基清除能力，保护海马神经元，增强神经突触可塑性，从而改善D-半乳糖导致的小鼠认知障碍，具体机制有待进一步深入研究。