丙泊酚改善缺氧诱导的宫颈癌细胞增殖、G2/M 期阻滞和辐射抗性*

毛远舟，郭巧姗，黄建鸣，邹江，陈一丁，张可贤，舒进军

610041 成都，四川省肿瘤临床医学研究中心，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学附属肿瘤医院 麻醉科（毛远舟、邹江、陈一丁、张可贤、舒进军） ，实验研究部（郭巧姗、黄建鸣）；610041 成都，四川省骨科医院 麻醉科（毛远舟）

宫颈癌是全世界范围内最常见的女性恶性肿瘤之一，也是女性癌症死亡的第4大原因［1］。针对宫颈癌的治疗，《宫颈癌诊疗指南》（2022 年版）［2］推荐，IA1 和IA2 期患者行手术治疗，IB1、IB2、IIA1 和IB3 期患者行手术治疗或者放疗，IIA2 及以上阶段的患者行同步放化治疗。由此可见，放化疗是宫颈癌治疗的重要手段。然而，辐射抗性是放疗有效性的关键影响因素。克服辐射抗性，对于提高宫颈癌治疗效果意义重大。缺氧作为绝大多数实体肿瘤中广泛存在的一种特质，与肿瘤的增殖、分化、血管生成、能量代谢以及癌症的耐药性发生、患者预后较差等均密切相关［3-5］。缺氧也在多种肿瘤中被证实是放疗失败的常见原因，包括宫颈癌［6］。丙泊酚是临床上常用的静脉麻醉药物，由于具有见效快、副作用少、镇静时间短等特点，被广泛用于各种手术中。除其麻醉作用外，丙泊酚的肿瘤抑制作用已在包括宫颈癌在内的多种肿瘤中得到深入探索［7-8］。据报道，丙泊酚联合氯胺酮使用，可有效减轻宫颈癌患者接受高剂量率腔内照射期间的疼痛和痛苦［9］。而且，丙泊酚促进了紫杉醇对宫颈癌细胞的化疗敏感性［7］，提示丙泊酚能改善宫颈癌的药物抗性。氯化钴（CoCl2）处理是最常用的缺氧化学诱导模型，其可模拟HIF-1α 的生成［10］。本研究拟通过CoCl2诱导处理Hela 细胞，构建宫颈癌细胞缺氧化学模型，旨在探讨丙泊酚对氯化钴环境下宫颈癌细胞增殖、G2/M 期阻滞和辐射抗性的作用及潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人源Hela 细胞株为本实验室保存；RPMI 1640培养基、热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素购自武汉普诺赛生物有限公司；丙泊酚和CoCl2购自Sigma-Aldrich公司；结晶紫购自广东科隆生物有限公司；甲醇购自Biosharp 公司；十二烷基硫酸钠购自生工生物有限公司；RNaseA 和藻红蛋白购自凯基生物有限公司；TRIzol 试剂购自无锡百泰克生物技术有限公司；Eastep RT Master Mix 试剂盒和Eastep qPCR Master Mix 试剂盒购自上海Promega；RIPA 裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂购自MCE 公司；7.5%凝胶和5%脱脂牛奶中封闭液购自Epi Zyme 公司；聚偏氟乙烯膜购自Immobilon-PSQ 公司；一抗（HIF-1α 和Tublin）购自CST 公司；二抗购自中杉金桥生物技术有限公司；人VEGF Valukine ELISA 试剂盒购自R&D Systems。

1.2 细胞培养

人源Hela 细胞复苏后，接种于含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素的 RPMI 1 640 培养基中，在37℃，5% CO2进行培养，每两天换一次液。

1.3 细胞活力测定

将对数生长期的Hela 细胞接种于两个96 孔板，每板中分别加入浓度为0 μM、200 μM、400 μM、600 μM、800 μM、1 000 μM 的丙泊酚。孵育72 h后，一个96 孔板置于常氧下，另一块板置于300 μM CoCl2下24 h。CoCl2的作用浓度和时间参考已发表文献［11-12］和本研究的预实验所确定。然后用1%结晶紫染色，并在10%乙醇中固定细胞5 min。剩余的结晶紫溶液用无菌水洗掉，待96 孔板干燥后，加入1%十二烷基硫酸钠裂解细胞，用酶标仪在A570 nm 处测定吸光度。细胞活力计算公式为：细胞活力（%）= ［光密度值（optical density，OD）实验组-OD 空白组］/（OD 对照组- OD 空白组）×100%。

1.4 流式分析

实验分为对照组、丙泊酚组、CoCl2组、CoCl2+丙泊酚组。CoCl2+丙泊酚组中的细胞先300 μM CoCl2处理24 h，然后再经250 μM 丙泊酚处理至72 h；CoCl2组中的细胞先300 μM CoCl 处理24 h，然后再经磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）处理至72 h；丙泊酚组中的细胞先PBS 处理24 h，然后再经250 μM 丙泊酚处理至72 h；对照组中的细胞先PBS 处理24 h，然后再经PBS 处理至72 h。各组细胞处理后，收集细胞，用预冷PBS 洗涤两次，并在预冷的80%乙醇中固定，4℃过夜。之后，细胞在PBS 中重悬，用RNaseA 孵育去除RNA 后，20 mg /mL 藻红蛋白染色标记DNA 含量。然后用BD Facs-Canto Ⅱ流式细胞仪分析DNA 含量来确定细胞周期分布，测定Hela 细胞在G0/G1、S 和G2/M 期的比例。

1.5 克隆形成实验

实验分组及细胞处理同1.4。将对数生长期的Hela 细胞接种于6 孔板，每孔接种细胞数为：0 Gy 组200 个、1 Gy 组600 个、2 Gy 组1 200 个、4 Gy组2 400 个。细胞经250 μM 丙泊酚、300 μM CoCl2处理48 h 后，暴露于0、1、2 或4 Gy 剂量的辐射中，2 小时后更换培养基。室温下使用X-RAD320 机器进行放射处理，剂量率为0.02 Gy/min，源-表面距离（source-to-surface distance，SSD）为50 cm。生长10 天后，用10% （v/v）甲醇固定菌落15 min，5%（g/v）结晶紫染色20 min。计数超过50 个细胞的菌落，菌落接种率以接种细胞中有活菌的百分率计算。对于每个辐射剂量组，细胞存活率计算为辐照细胞的接种率除以对照组的接种率。接种率计算为（菌落形成数/接种细胞数）× 100%。存活率计算为菌落数/（接种细胞数×接种效率）。将生存分数的对数与辐射剂量作图，生成生存曲线。D0、Dq 和SF2 的取值采用单击多靶模型。D0 为平均致死剂量，理论上是使每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量；Dq（dose quasithreshold）为准阈剂量，表征修复亚致死损伤的能力，即克服单击多靶曲线中“肩宽”所需的剂量；SF2（survival fraction at 2 Gy）为2Gy 时存活分数，是代表细胞放射敏感性的重要指标，SF2 越大，放射抗拒性越强。

1.6 荧光定量PCR

细胞经250 μM 丙泊酚和300 μM CoCl2处理1 h、2 h 和4 h 后收集细胞。TRIzol 提取总RNA 后，使用Eastep RT Master Mix 试剂盒合成cDNA，并使用Eastep qPCR Master Mix 试剂盒进行qPCR。采用2-ΔΔCt方法分析数据，GAPDH作为内参基因。引物由擎科生物科技公司合成，引物列表见表1。

表1 引物序列列表Table 1.Sequences of Primers Used in the Present Study

1.7 免疫印迹实验

细胞经250 μM 丙泊酚、300 μM CoCl2处理48 h后，收集所有细胞。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取蛋白。20 μg 蛋白样品使用7.5%凝胶，在120 V 下分离90 min，并在140 mA 下转移1 h 到聚偏氟乙烯膜，然后在5%脱脂牛奶中封闭1 h 后， 4℃一抗孵育过夜。冲洗3 次后，将膜与二抗在室温下孵育2 h。用Ge 发光图像分析仪- imagequant LAS 500 对蛋白条带进行可视化成像。

1.8 酶联免疫吸附实验

细胞经250 μM 丙泊酚和300 μM CoCl2处理48 h 后，收集所有细胞。使用人VEGF Valukine ELISA试剂盒定量培养基中分泌蛋白VEGF的水平。

1.9 统计学方法

应用统计软件 SPSS 22.0 处理数据，以均数±标准差表示计量资料。单因素方差分析用于多组间比较。P＜ 0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 丙泊酚抑制CoCl2 处理后的Hela 细胞增殖

在常氧和CoCl2处理条件下丙泊酚均能抑制Hela 细胞增殖，且呈剂量依赖性。分析发现两种处理条件下丙泊酚的IC50（P= 0.066）和IC20（P= 0.990）差异无统计学意义，CoCl2处理条件下丙泊酚的IC50和IC20分别是450 μM 和250 μM（图1）。

图1 丙泊酚抑制Hela 细胞增殖Figure 1.Propofol-Inhibited Proliferation of Hela Cells

2.2 丙泊酚诱导CoCl2 处理后的Hela 细胞G2/M期阻滞

与对照组相比（图2 A，E 和F，表 2），CoCl2组（图2B，E 和F，表 2）中G0 /G1/S 期的细胞比例显著增加（P＜ 0.001），但G2/M 期的细胞比例显著减少（P＜ 0.001）。丙泊酚组（图2C，E 和F，表 2）与对照组相比，G0 / G1 / S 期的细胞比例减少（P= 0.162），G2/M 期的细胞比例增加（P= 0.058），但差异无统计学意义。 CoCl2+丙泊酚组（图2D，E 和F，表2）中G0 / G1 / S 期的细胞比例显著低于CoCl2组（P＜ 0.001），而G2/M 期的细胞比例显著高于CoCl2组（P＜ 0.001）。这些结果表明，丙泊酚诱导CoCl2处理后的Hela 细胞G2/M 期阻滞。

图2 丙泊酚诱导CoCl2 处理后的Hela 细胞G2/M 期阻滞Figure 2.Propofol-Induced G2/M Phase Arrest in CoCl2-Treated Hela Cells

表2 丙泊酚诱导CoCl2 处理后的Hela 细胞周期分布百分比（%）Table 2.Cell Cycle Distribution of CoCl2-Treated Hela Cells after Propofol Induction （%）

2.3 丙泊酚增强CoCl2 处理后的Hela 细胞的放射致敏性

与对照组相比，丙泊酚组细胞在0、1、2、4 Gy 剂量的辐射处理后，D0（P= 0.007）、Dq（P= 0.004）和SF2 的值均降低（图3），表明丙泊酚具有放射致敏作用。计算得到丙泊酚的放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）D0 为2.230（表3）。CoCl2组的细胞在0、1、2、4 Gy 剂量辐射后，Dq（P＜ 0.001）和SF2 值均高于对照组（图3），表明CoCl2处理增强了Hela 细胞辐射抗性。CoCl2+丙泊酚组细胞在0、1、2、4 Gy 剂量辐射后，其D0（P＜ 0.001）、Dq（P＜ 0.001）和SF2 值均低于CoCl2组（图3），表明丙泊酚改善了CoCl2诱导的辐射抗性（表3）。计算得到丙泊酚+CoCl2的SERD0 为2.595（表3）。

图3 丙泊酚增强CoCl2 处理后的Hela 细胞的放射致敏性Figure 3.Radiosensitization Enhanced by Propofol in CoCl2-Treated Hela Cells

表3 丙泊酚对CoCl2 处理后的Hela 细胞放射生物学参数的影响Table 3.Influence of Propofol on Radiobiological Parameters of CoCl2-Treated Hela Cells

2.4 丙泊酚下调CoCl2 处理后的Hela 细胞中HIF-1α 和VEGF 基因表达水平

处理2 h 和4 h 后，CoCl2组的HIF-1αmRNA 表达水平显著高于对照组（P＜ 0.001，图4A）。处理4 h 后，与CoCl2组相比，CoCl2+丙泊酚组的HIF-1αmRNA 表达水平显著降低（P＜ 0.001，图4A）。处理1 h、2 h 和4 h 后，CoCl2组的VEGFmRNA 表达水平显著高于对照组（P＜ 0.001，图4B）。在处理1 h（P= 0.003）和2 h（P= 0.034）后，丙泊酚组的VEGFmRNA 均显著高于对照组（图4B），表明丙泊酚促进了Hela 细胞中VEGF基因表达。在处理1 h（P= 0.630）、2 h（P= 0.060）和4 h（P= 0.058）后，CoCl2+丙泊酚组VEGFmRNA 表达量低于CoCl2组，但差异无统计学意义（图4B）。

图4 丙泊酚下调CoCl2 处理后的Hela 细胞中HIF-1 α 和VEGF 基因表达水平Figure 4.Propofol Down-regulated the Relative mRNA Expression Level of HIF-1 α and VEGF in CoCl2-Treated Hela Cells

2.5 丙泊酚下调CoCl2 处理后的Hela 细胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表达水平

在对照组和丙泊酚组中，均未在Hela 细胞中检测到HIF-1α 的明显表达（图5）。Hela 细胞在CoCl2处理48 h 后，HIF1α 的相对蛋白表达水平显著增加（P＜ 0.001，图5），而丙泊酚处理后，此增加显著衰减（P＜ 0.001，图5）。此外，ELISA 结果显示，与对照组相比，VEGF 蛋白分泌水平在CoCl2和丙泊酚单独处理48 h 后均显著升高（P＜ 0.001，图6）。与CoCl2组相比，CoCl2+丙泊酚组的VEGF 蛋白分泌水平显著降低（P＜ 0.001，图6）。

图5 丙泊酚下调CoCl2 处理后的Hela 细胞中HIF-1α 蛋白表达水平Figure 5. Propofol Down-regulated the Protein Expression Level of HIF-1α in CoCl2-Treated Hela Cells

图6 丙泊酚下调CoCl2 处理后的Hela 细胞中VEGF 蛋白表达水平Figure 6.Propofol Down-regulated the Protein Expression Level of VEGF in CoCl2-Treated Hela Cells

3 讨 论

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，放化疗是宫颈癌治疗的常规手段，辐射抗性却极大地限制了放化疗的疗效。缺氧作为绝大多数实体肿瘤中广泛存在的一种特质，不但与肿瘤的发生发展密切相关，也会促进肿瘤的辐射抗性，严重影响放化疗的疗效。丙泊酚作为临床上常用的静脉麻醉药物， Jin 等［7］研究报道其促进了紫杉醇对宫颈癌细胞的化疗敏感性。本研究首先通过CoCl2诱导在Hela 细胞上构建了缺氧模型。CoCl2诱导的化学模型是最常用的缺氧模拟物。虽然它在Hela 细胞的功能和表型方面与许多缺氧诱导基因不重叠，但它在常氧环境中稳定HIF-1α 数小时并增加VEGF 表达，使其适用于该项目［10］。本研究发现，丙泊酚抑制CoCl2处理后的Hela 细胞的增殖，诱导G2/M 期阻滞，改善辐射抗性，以及下调HIF-1α 和VEGF 表达水平。

除了麻醉作用外，丙泊酚在肿瘤上的作用得到越来越多的关注［13］。Jin 等［7］报道，丙泊酚抑制了宫颈癌细胞（HeLa 和 CaSki）的增殖、迁移和侵袭，同时促进了凋亡。Du 等［8］研究发现丙泊酚抑制了宫颈癌细胞（Caski 和SiHa）活性、克隆形成和侵袭。本研究结果显示，丙泊酚抑制了Hela 细胞的增殖，且呈浓度依赖性。进一步研究发现，丙泊酚诱导了G0/G1/S 期的细胞比例显著减少。此外，丙泊酚还浓度依赖性地抑制了CoCl2处理后的Hela 细胞增殖。CoCl2诱导了Hela 细胞G0/G1/S 期细胞比例的显著增加以及G2 / M 期细胞比例的显著减少，但丙泊酚处理反转了此结果。综上，丙泊酚抑制CoCl2处理后的Hela 细胞增殖，可能是通过诱导G2/M 期阻滞。

缺氧常见于实体瘤，包括宫颈癌。有几个因素导致肿瘤的缺氧［14］。癌细胞的快速增殖导致对氧气和营养物质的需求增加，超过了供应肿瘤的新血管的形成。此外，肿瘤血管的不规则和异常结构导致氧气输送效率低下［15］。而且，癌细胞通常会改变新陈代谢，导致氧气消耗增加［16］。肿瘤微环境中的缺氧对癌症进展和治疗耐药性有重大影响。它影响肿瘤生物学的各个方面，包括血管生成（新血管的形成）、转移（癌细胞扩散）、免疫抑制以及对化疗和放射治疗的抵抗力［3-5］。本研究发现，CoCl2组的细胞在0、1、2、4 Gy 剂量辐射后，Dq 和SF2 值均高于对照组，表明CoCl2处理增强了Hela 细胞辐射抗性。丙泊酚单独处理，或者和CoCl2联合处理，均降低了细胞在0、1、2、4 Gy 剂量辐射后的Dq、SF2 和D0值，表明丙泊酚具有放射致敏作用，且丙泊酚改善了CoCl2诱导的辐射抗性。

HIF-1α 是低氧环境下促进肿瘤侵袭和转移的主要调节因子，它可以促进肿瘤组织处血管生成，促进血红蛋白生成等，给肿瘤细胞带来氧气供给。本研究发现CoCl2处理后，HIF-1α 的转录和翻译表达水平均显著上调，表明低氧诱导了HIF-1α 表达上调。VEGF 是HIF-1α 的主要调节因子，已被证明在肿瘤生长和转移的分子发病机制中发挥重要作用。抑制VEGF 是癌症治疗的关键治疗策略，当肿瘤细胞和周围基质分泌VEGF 时，它可以刺激内皮细胞的增殖和存活，从而导致新血管的形成［17］。既往研究报道，高氧降低HIF-1α 和VEGF 水平，导致低氧HeLa 细胞放射敏感性增强［18］。抗VEGF 治疗联合放疗和化疗对宫颈癌的治疗被证明是有效的［19］。Ishikawa 等［20］通过免疫组化染色分析了38名接受放射治疗的FIGO ⅢB 期宫颈鳞状细胞癌患者的HIF-1α表达水平，发现HIF-1α 高表达与疾病复发呈显著正相关，且无复发生存率较低，因此，HIF-1α是预测FIGO ⅢB 期宫颈鳞状细胞癌患者放疗后的未来转移的重要预后因素。大量体外研究表明，丙泊酚可下调HIF-1α［21-24］。关于丙泊酚抑制HIF-1α 表达的机制，有报道称丙泊酚抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）活性，MAPK 和PI3 激酶活性在决定mRNA对HIF-1α 的翻译率中起重要作用［24］。然而，丙泊酚在20%或5% O2条件下，通过阻断HIF-1α亚基的合成，可逆地抑制HIF-1α活性和由HIF-1α介导的基因表达，而丙泊酚在1% O2条件下则没有此作用［25］。本研究结果显示，丙泊酚下调CoCl2处理后的Hela 细胞中HIF-1α 和VEGF 基因和蛋白表达水平。

综上所述，本研究发现，丙泊酚抑制CoCl2处理后的Hela 细胞的增殖，诱导G2/M 期阻滞，改善辐射抗性，以及下调HIF-1α和VEGF 表达水平。然而，已知HIF 通过泛素-蛋白酶体系统调节其降解，CoCl2通过抑制脯氨酰羟化酶（prolyl-4-hydroxylases，PHD）来增加HIF 的蛋白质含量。因此，丙泊酚对PHD 活性和蛋白酶体系统的影响应进一步得以研究。此外，细胞周期结果显示，CoCl2和/或丙泊酚处理后细胞碎片数量有明显增多，推测药物处理可能促进细胞凋亡，因此，后续应通过流式细胞术对细胞凋亡做进一步分析。本研究为宫颈癌治疗提供了一定的理论依据。

作者声明：本文全部作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；并承诺论文中涉及的原始图片、数据资料等已按照有关规定保存，可接受核查。

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网（CNKI）科技期刊学术不端文献检测系统的学术不端检测。

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

文章版权：本文出版前已与全体作者签署了论文授权书等协议。