等温扩增技术应用于虾肝肠孢虫检测的研究进展

谭念秋，魏春梅，文钰淞，范晓东

(重庆师范大学生命科学学院，重庆 400000)

目前，对虾养殖业是世界水产养殖的重要组成部分，产值超过260亿美元[1-2]。但在养殖过程中，对虾一直受到各种病原(真菌、细菌、病毒、寄生虫等)的威胁，如虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)等[3]。EHP隶属于肠孢虫属(Enterocytozoon)，是一种专性细胞内寄生虫，主要感染对虾肝胰腺上皮细胞[4]，传播途径可分为水平传播和垂直传播。从幼虾到成虾的各成长阶段均会感染EHP，虽然感染后的对虾不会死亡，但会出现摄食减少、生长缓慢等病症[5]。目前尚无有效治疗EHP感染的特效药，导致该病难以防治，给养殖户造成了极大的经济损失，严重影响了对虾养殖业的发展[6-7]，如2014—2015年印度对虾产业因受EHP感染，年产量减少10%～20%，经济损失达数千万美元[8]。

近年来，EHP在中国、委内瑞拉、泰国、马来西亚、越南等国家大面积暴发[9-11]，在尚未发现有效治疗EHP方法的情况下，对其进行预防检测就显得尤为重要。EHP的检测手段主要包括组织病理学检测和分子生物学检测，其中属于分子生物学检测领域中的等温扩增技术因具有简便性、低成本、较高的灵敏度和特异性等优点而成为重要的田间检测技术。为此，本文拟对EHP的常规检测方法进行综述，重点介绍环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)和重组酶等温扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)检测技术及其在EHP检测中的应用，以期能在EHP感染早期进行阳性筛查，为EHP的高效防治提供理论参考。

1 EHP的检测方法

在EHP感染早期，宿主无明显、特定的病理特征，因此无法通过直观视觉诊断EHP感染，需要借助现有的光学仪器设备及相关的分子检测手段。目前，EHP的检测方法主要包括组织病理学、原位杂交以及分子生物学等。

组织病理可通过光学显微镜、相差显微镜对感染的组织切片进行观察[4]，而各种染色技术的应用则使感染肝胰腺组织中的EHP能被更清晰地观察到[12]。但组织病理学观察适用于感染后期，EHP感染早期的组织切片因无明显感染的组织学迹象，容易产生漏检而导致检测人员错误判断，如Salachan P V等[13]研究发现，组织病理学观察无法判断是否感染了微孢子虫，但其核酸检测为强阳性。Zhao R H等[14]利用荧光染色剂钙荧光白(Calcofluor white，CFW)对EHP进行检测，结果表明其可快速检测悬液、粪便中的EHP孢子，但该方法特异性和灵敏度较差。组织病理学观察适用范围有限，容易造成假阴性，只能作为辅助性的EHP检测方案。

原位杂交常作为一种辅助组织病理检测的手段而被应用于EHP的检测[15-18]。如Tangprasittipap A等[18]利用地高辛标记探针，开发了一种用于EHP检测的原位杂交方法，其具有良好的灵敏度和特异性。但该方法操作复杂，无法在现场进行快速检测，需在实验室条件下进行使用。

EHP的分子生物学检测技术主要包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量 PCR(Quantitative real-time PCR，RT-PCR)、等温扩增方法(LAMP和RPA)、数字PCR等。PCR是世界动物卫生组织方案中概述的许多虾病诊断的金标准[3]，在EHP检测中常用的方法主要有巢式PCR[18]和一步法PCR[19]。目前，在EHP的检测中，研究者常用SSU-rRNA和SWP等基因作为检测靶标[15-20]。其中SSU-rRNA作为检测靶标是早期主要的PCR检测方法，但存在特异性低等问题，而现在的研究以SWP和β-tubeulin等为检测靶标[21]，有效地提高了PCR检测的特异性。汪浩等[22]基于EHP孢壁蛋白建立了荧光定量检测体系，该方法在5.02×101～5.02×108copies/μL范围内具有良好的线性关系；马来等[23]研发了基于TaqMan-MGB探针的荧光定量检测方法，对虾样品的检测下限为10 copies/mg；Zhang H等[24]建立了灵敏、准确的双链液滴数字PCR(ddPCR)方法，可以同时检测和定量两种病原体，其中EHP的检测下限为2.3 copies/μL，极大地提高了检测灵敏度。采用PCR、荧光定量PCR以及数字PCR检测EHP时，需要借助聚合酶链反应核酸扩增仪、数字PCR检测仪等仪器，因而只能在实验室进行检测，无法在田间进行快速检测。等温扩增技术是基于传统分子生物学方法而发展起来的，通过水浴锅、恒温仪等设备，在恒温条件下快速放大目的基因，操作简单，具有发展为快速高效的现场检测方法的潜力。目前用于EHP的等温检测技术主要包括LAMP和RPA等[25]。陈进会等[26]基于18S基因建立了检测EHP的LAMP检测方法；黄纪徽等[27]分别以EHP的SWP和SSU-rRNA为靶标建立了实时荧光RPA检测方法。

随着科技发展，研究人员对以上检测方法进行了持续改良，以期寻找到特异性强、灵敏度高的方法，但各种技术手段都存在明显的优缺点(表1)，在进行检测时，应根据需求选择最佳的实验方法。Thawatchai C等[3]比较了几种检测EPH的技术，其中巣氏PCR、RT-PCR、LAMP、RPA的灵敏度最高，各种检测技术的特异性与靶标基因相关，其中PTP2和SWP基因的特异性最佳，而组织病理学的灵敏度和特异性相对较差，因此靶标基因的选择与实验技术的改良同等重要。

表1 EHP常规的检测技术比较Tab.1 Comparison of detection techniques for EHP

2 等温扩增技术的研究进展

等温扩增技术的反应过程始终保持恒温状态，通过添加不同活性的酶和特异性引物达到快速扩增核酸的目的，因其具有高灵敏度、高特异性、低成本、操作方便等特点而被广泛应用于检测食源性和环境病原体，但LAMP和RPA并未被大范围应用。随着对交叉学科研究的增多，研究者结合荧光染料、探针等手段对LAMP和RPA的方法进行改良，拓展了其应用领域。

2.1 LAMP研究进展

LAMP是一种能在恒定温度下，利用特异性引物和具有链置换特性的Bst.DNA聚合酶快速扩增的技术，具有低成本、检测操作简单快捷、特异性强和灵敏度高[25]等特点，是能够被推广并应用到田野上的检测技术。常规的LAMP存在较多的缺点，如扩增后产物不易被分析[28]、缺乏特异性高且成本较低的染料、扩增产物容易造成气溶胶污染、导致假阳性[29]等。

为弥补LAMP的不足，研究者们将各种染料加入LAMP反应中，Wu C等[30]通过在LAMP体系中加入显色灵敏的金属指示剂羟基萘酚蓝(HNB)，建立了一种快速可视化检测金黄色葡萄球菌的方法，这是一种有巨大潜力的快速诊断金黄色葡萄球菌感染的技术手段。常规的LAMP检测只关注基因扩增后的结果，而荧光实时定量方法不仅可以实时观察基因扩增情况，且可以对基因进行定量分析，能更加直观地获得实验数据[31]。Gadkar V J等[32]在环引物的3’端连接了一个羧基荧光素基团，探针仅在与靶标结合时发出荧光，而在未结合状态时淬灭，可更直观地观察扩增结果；Elbeaino T等[33]将Taqman荧光探针应用于LAMP中，结果显示该方案有效地提高了LAMP的特异性，避免了假阳性；Lin F等[34]设计了一种双重逆转录-环介导横温扩增技术与横向流动试纸条(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification and lateral flow dipstick，RT-LAMP-LFD)检测法来检测引起虾白尾病的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)诺达病毒(MrNV)与超小型病毒(XSV)，将异硫氰酸荧光素(FITC)标记在内引物FIP的5’端上，该方法的特异性强和灵敏度高。

2.2 RPA的研究进展

RPA是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件下(最佳温度37 ℃)进行核酸扩增的技术[35-36]。近年来，由于RPA的检测时间极短，因此许多研究者将其应用于病原微生物的检测。如Kersting S等[37]利用RPA的原理发明了一种能同时进行多重检测的芯片，可在20 min内检测不同的病原体，其对金黄色葡萄球菌和肠道沙门氏菌的检出限均为10 cfu；Kim T H等[38]开发了一种用于检测牛奶样品中沙门氏菌的离心微流体设备，该设备可在30 min内以全自动工作流程完成DNA提取、RPA反应和产品检测等过程。

与LAMP相同的是，RPA常规的结果分析方法为电泳检测，因此其无法被用于快速检测。近年来，随着基因编辑技术的发展，研究者们将RPA与CRISPR-Cas12a结合，再应用于微小隐孢子[39]、非洲猪瘟[40]、支原体[41]以及(SARS)-CoV-2[42]的现场快速检测。此外Wang Y等[43]建立的RPA侧向流试纸条(RPA-LFS)方法通过在RPA反应系统的5’端添加异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)标记的探针、用生物素标记反向引物的5’端，将其作为扩增产物在试纸条上反应时的比色指示剂，结果表明RPA与试纸条的结合进一步提高了该技术的灵敏度和特异性，其对病原体检测下限为1 cfu/μL。Ge R等[44]研究了RPA与光电化学(Photoelectrochemistry，PEC)生物传感器结合的技术(RPA-PEC)，这也为便捷检测病原奠定了基础。

3 应用于检测EHP的等温扩增技术

3.1 LAMP对EHP的检测

自从发现等温扩增技术能低成本且快速灵敏地检测EHP，研究者们便将研究的热点转移到对等温扩增技术的改良上，试图找到一种最佳的检测方案，以实现在现场快速、准确地可视化检测EHP。为实现此目的，研究者们将LAMP与荧光染料结合起来，并进行了诸多探索。如Ma B等[45]将SYTO-16 DNA结合染料应用于LAMP，开发出一种新的技术——实时定量环介导等温扩增(Quantitative loop-mediated isothermal amplification，qLAMP)，其既能实时观察，也能有效提高EHP检测的灵敏度；Kumar T S 等[46]利用SYBRTMgreen Ⅰ染料在封闭管系统中目视检测扩增的LAMP产物，建立了一种可视化的LAMP方法，在农场水平诊断EHP方面具有巨大的发展潜力。由于EHP可通过水体传播和亲本垂直传播，因此在孵化前筛选亲本、在虾池放养前筛选幼体、检测自然携带者对对虾健康养殖十分重要。在对虾养殖过程中，除了EHP外，其他病原也会造成对虾生长异常，如白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、十足类虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1，DIV1)，对虾在患病时免疫力会随之下降，更容易感染其他病原体。Hu K S等[47]建立了一种能以特异性检测EHP、WSSV、DIV1病原的基于LAMP的微流控芯片技术，其能同时检测虾体内的多种病原，最大程度地节约时间和成本，满足快速检测的需求。李英瑕等[48]设计了一种基于LAMP原理的EHP现场快速检测试剂盒，其满足了灵敏度、特异性、重复性、稳定性及简便快捷的现场检测要求，可被用于对虾养殖场EHP的检测。

3.2 RPA对EHP的检测

在EHP检测中，RPA对温度的要求比LAMP低，但检测速度更快。2020年，Zhou S H等[49]首次将RPA应用于虾EHP的检测，实验表明RPA在30 ℃恒温、反应40 min条件下，即可出检测结果，且无交叉反应，但其灵敏度与PCR相当，而低于RT-PCR。Kanitchinda S等[50]将RPA和CRISPR-Cas12a结合，最低可以检测到50个拷贝的DNA，虽然这个过程需要在37 ℃下反应1 h，但是可以通过紫外/蓝光激发或者横向流动进行检测，从而实现肉眼观察的可能。Li G等[51]开发了一种实时RPA方法，其条件为38.5 ℃反应15 min，检测限达到10 copies/μL DNA。Ma C等[52]将荧光分析与RPA系统相结合，可在39 ℃、3～7 min内快速检测EHP，且能达到每个反应12 copies/μL DNA，有效地缩短了检测的时间、保证了检测的质量。Yang L H等[53]将激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)的核酸酶PfAgo与RPA结合，将灵敏度提高到了单拷贝，是目前灵敏度最高的分子检测方法。

近些年来，随着分子生物学的发展，等温扩增技术体系的灵敏度、特异性以及便携性显著提高。在EHP检测中，靶标基因的选择十分重要，优良特异的靶标可以有效地提高检测的灵敏度和特异性，以便更早地诊断出EHP的感染，有利于早期防治。目前，EHP的分子检测主要是以SSU-rRNA[15]、SWP[20]、PTP2[54]、18S[25]、β-tubulin[21]为靶标基因，其中SWP、PTP2特异性较高，适合用于各种检测方案的建立。随着对EHP研究的不断深入，研究者们将会获得更多的EHP感染后特异表达的潜在标记基因，并将它们应用于对其检测和防治技术的提升的工作中。近5年等温扩增技术在EHP检测中所使用的靶标基因如表2所示。

表2 等温扩增在EHP检测中的靶标基因Tab.2 Targets for isothermal amplification in EHP detection

续表2

4 结语

EHP对全世界对虾养殖业构成了严重的威胁，同时由于有效治疗EHP感染的方法尚未被发现，因此，EHP感染的早期诊断和预防对对虾养殖产业的健康发展具有重大意义。

尽管组织学观察、原位杂交、巢氏PCR、qPCR等技术方法应用在检测EHP感染上已较为成熟，但这些方法存在反应时间长、依赖实验室和昂贵设备等缺点，限制了其在野外的大规模使用。而等温扩增检测技术具有简便、快捷、不需要昂贵设备等优点，具有应用于EHP现场检测的潜力。随着等温扩增技术研究的深入，研究者通过在等温扩增体系中加入荧光染料、探针等以解决灵敏度差、无法直接观察等问题，以便该技术能更好地应用于EHP的现场检测。此外，现有报道中通过等温扩增检测技术的改良方案所获得的实验数据仅仅是在实验室条件下，最终将其应用于EHP的现场检测还需要对实验方案进行优化，同时还需降低检测成本，开发出一种简单、成熟的试剂盒，以便对虾养殖人员进行独立检测。

随着现代交叉学科研究的不断深入，等温扩增技术本身存在的局限性会被进一步突破，未来可能会形成一套成熟的等温扩增技术体系并应用于EHP及其他虾病的联合检测。此外，等温扩增技术与试纸条及核酸适配体等进行联合可能会成为未来快速检测判断病原微生物感染的新技术。