基于改进逼近理想解排序法的复合菌固态发酵平菇菌糠饲料参数优化

张立东 段平平 李昌昌 胡丽红 陆牡龙 许贵善,2*

(1.塔里木大学动物科学与技术学院,阿拉尔 843300;2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室,阿拉尔 843300)

优质饲料原料缺乏及其成本问题一直是困扰畜牧业快速发展的重要因素[1]。缓解饲料原料供需矛盾,需要加快优质非常规饲料资源的开发和利用。食用菌生产中采集菌菇后剩余的废弃物培养基,称为菌糠(SMS),又叫菌棒、菌渣[2]。我国是食用菌生产大国,据中国食用菌协会报道[3],2020年全国食用菌总产量4 061.43万t,比2019年增长3.2%,其中平菇(Pleurotusostreatus)作为食用菌家族中的大宗品种,在2020年产量达到682.96万t。按每生产1 kg的食用菌产生3.25～5.00 kg菌糠计[4],2020年我国产生食用菌菌糠总量在13 199.65万～20 307.15万t,其中平菇菌糠(P.SMS)总量在2 219.62万～3 414.80万t。

目前,处理和利用菌糠的方式为焚烧、还田、开发生物质燃料、用作饲料和提取菌糠中的活性成分。但绝大部分菌糠被焚烧或随意丢弃,造成环境污染和资源浪费。菌糠本身含水量高、不易保存、粗纤维含量较高、适口性差,直接制备畜禽饲料效果不好。添加微生物发酵可以改善菌糠适口性,延长菌糠储存时间,且能提高菌糠的营养价值。刘月等[5]在假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌菌液的用量比为6.8∶1.0、水料比为1.0∶1.1、菌液接种量为6.8%条件下发酵灵芝菌糠,发现发酵后的灵芝菌糠感官品质有较大改善,酒香味明显,粗蛋白质(CP)含量提高14.51%,粗纤维(CF)含量略有降低。李佳腾等[6]用混菌发酵杏鲍菇菌糠,发现发酵后的杏鲍菇菌糠CP和粗脂肪(EE)含量显著高于原料,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量显著低于原料。饲料原料经过微生物发酵后饲喂动物有较好的效果。Peng等[7]研究证明,微生物发酵饲料可以通过减少致病微生物来调节盲肠微生物群,从而改善有益微生物,同时也影响免疫力及其相关基因的表达。Yan等[8]研究发现,7.5%发酵饲料对鹅的体重和平均日增重有增加的趋势,增加拟杆菌属的丰度,并可能影响宿主生长、营养状况和肠道健康。王乐乐等[9]研究发现,饲粮中添加12%的发酵木屑菌糠在一定程度上提高了绵羊免疫功能和抗氧化性能,对绵羊生长性能和营养物质表观消化率无负面影响。因此,菌糠发酵饲料具有较好的利用价值和饲喂效果。

微生物发酵饲料的品质和营养不仅由饲料原料和菌种决定,还与菌液接种量、物料含水量、发酵时间和温度等条件密切相关[10]。平菇菌糠饲料的最佳发酵工艺需分别对多因素和多指标进行筛选评价,针对多因素的筛选,正交试验、响应面法的试验次数少且结果更准确。陈诗宇等[11]采用单因素和正交试验优化黑曲霉和乳酸杆菌二段固态发酵大豆皮和菜籽饼工艺条件,分别筛选出了黑曲霉和乳酸杆菌的最优发酵工艺。刘战霞等[12]通过单因素和正交试验对益生菌发酵南瓜子进行工艺优化,发现最优工艺条件为发酵时间5 d、接种量5%、菌种比例1∶1、发酵温度36 ℃。饲料价值评价需考虑营养成分和发酵品质等多个指标,指标间易相互影响,某一条件不一定对多个指标同时有效。Rane等[13]运用空间分析多影响因子法(MIF)和逼近理想解排序法(TOPSIS),考虑12个气候、地球物理和可达性因素对坝址建设潜力进行评价,得到5个适宜建坝地点。王彦等[14]通过改进TOPSIS评价不同酶、菌及复合酶菌制剂对葡萄籽混合饲料的发酵效果,发现在25和30 ℃下添加1×109CFU/kg的植物乳杆菌发酵15 d效果较优。本试验采用TOPSIS对多个指标进行综合评价。TOPSIS是多目标决策分析中一种常用的有效方法,通过计算评价对象与最优解、最劣解的距离来进行排序,若评价对象最靠近最优解又最远离最劣解,则为最好,否则为最差[15]。

本试验以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,BS)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,LP)为发酵菌种,以平菇菌糠和玉米粉为发酵底物,采用单因素试验探究发酵条件的最适范围,作为六因素三水平正交试验的水平以常规营养成分和发酵品质的综合评分为评价指标,结合严少乐等[16]将熵权法内嵌至TOPSIS中获取指标权重的改进TOPSIS综合评价,探究玉米粉添加量、菌液接种量、物料含水量、菌种比例、发酵时间及发酵温度对复合益生菌发酵平菇菌糠的影响,以期优化菌糠饲料发酵条件,推动菌糠资源饲料化利用,解决饲料供需矛盾。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵底物为出菇三茬后的平菇菌糠,取自新疆阿拉尔市某平菇种植基地,平菇培养基由棉籽壳、锯末、小麦麸、石灰等原料组成。发酵原料营养水平见表1。试验菌种BS:选用LB液体培养基,置于37 ℃,150 r/min、恒温摇床培养12 h,采用稀释平板涂布的方法进行活菌数测定,测得活菌数≥1×1010CFU/mL;试验菌种LP:选用MRS液体培养基,置于37 ℃,厌氧、静置培养12 h,采用稀释平板涂布的方法进行活菌数测定,测得活菌数≥1×1010CFU/mL。带有单向透气阀的聚乙烯发酵袋购自浙江某塑业公司。

表1 发酵原料营养水平(干物质基础)

1.2 单因素试验设计

以原料平菇菌糠和辅料玉米粉作为发酵底物,自然pH条件下进行发酵试验。发酵结束后,在65 ℃烘箱中烘至恒重,在空气中回潮24 h,粉碎过40目筛,用于测定CP、EE、NDF、ADF含量,干物质损失率,pH和氨态氮(NH3-N)含量。

1.2.1 玉米粉添加量

玉米粉添加量以0、5%、10%、15%、20%和25%(添加的玉米粉干重与菌糠干重的比值)为单因素,每组3个重复,菌液接种量12%,BS和LP菌种比例1∶1,物料含水量80%,发酵时间7 d,发酵温度37 ℃。

1.2.2 菌液接种量

菌液接种量以4%、8%、12%、16%、20%、24%(BS和LP混合液的总体积与菌糠干重的比值)和空白(不接种菌液)为单因素,每组3个重复,玉米粉添加量按优化结果选取,BS和LP菌种比例1∶1,物料含水量80%,发酵时间7 d,发酵温度37 ℃。

1.2.3 物料含水量

物料含水量以50%、60%、70%、80%、90%和100%(超纯水和菌液总质量与菌糠干重的比值)为单因素,每组3个重复,玉米粉添加量和菌液接种量按优化结果选取,BS和LP菌种比例1∶1,发酵时间7 d,发酵温度37 ℃。

1.2.4 BS和LP菌种比例

菌种比例以BS和LP 2种菌种复配比例(3∶1、1∶3、1∶1、2∶1、1∶2)以及BS与LP分别单菌发酵为单因素,每组3个重复,玉米粉添加量、菌液接种量和物料含水量按优化结果选取,发酵时间7 d,发酵温度37 ℃。

1.2.5 发酵时间

发酵时间以1、4、7、10、13和16 d(发酵饲料制作完成至将发酵袋取出培养箱所经历的时间)为单因素,每组3个重复,玉米粉添加量、菌液接种量、物料含水量和BS和LP菌种比例按优化结果选取,发酵温度37 ℃。

1.2.6 发酵温度

发酵温度以25(平均室温)、37、50和60 ℃(培养箱的温度)为单因素,每组3个重复,玉米粉添加量、菌液接种量、物料含水量、发酵时间和BS和LP菌种比例按优化结果选取。

1.3 正交试验

综合前人对发酵菌糠的研究以及单因素试验,基于正交试验设计原理,选取玉米粉添加量、菌液接种量、物料含水量、发酵时间、BS和LP菌种比例、发酵温度6个具有代表性因素,每个因素3个水平,本研究不考虑因子间的交互作用,仅考虑主效应,选取L18(36)正交表进行试验,正交试验设计见表2。用电子秤称取100 g平菇菌糠,按照单因素与正交试验设计算玉米粉的质量、所需BS和LP复合菌液的体积数以及所用水的体积数(扣除菌液总体积),将菌液倒入水中摇匀,均匀洒在和玉米粉混合均匀的平菇菌糠上,拌匀之后装入聚乙烯呼吸袋中,每组3个重复,单室真空包装机抽真空后,按照试验设计的温度放入恒温培养箱中,到试验设计的时间取出。取10 g样品于250 mL锥形瓶,加入90 mL蒸馏水在4 ℃冰箱保存24 h用于测定pH及NH3-N、乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)含量。其余样品65 ℃烘干经中药粉碎机粉碎后装入自封袋用于测定CP、EE、NDF、ADF含量及干物质损失率。发酵结束后测定各组营养成分和发酵品质,根据改进TOPSIS中应用熵权法得到综合评分分析发酵效果,筛选出发酵参数较优组合。

表2 L18(36)正交试验设计

1.4 指标测定

1.4.1 营养成分

饲料中DM、CP、NDF、ADF、EE含量分别参照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2006、NY/T 1459—2007和GB/T 6433—2006的方法测定。

干物质损失率(%)=[(发酵前DM重量-发酵后DM重量)/原料DM重量]×100。

1.4.2 发酵品质

称取样品10 g,加入90 mL蒸馏水,放入4 ℃冰箱24 h后用4层纱布过滤,挤净残渣中的浸提液,用定量滤纸过滤备用。使用pH计测定pH;采用苯酚-次氯酸钠比色法[17]测定NH3-N含量;采用Thermo Scientific UltiMate 3000型高效液相色谱仪[UltiMate XB-C18型色谱柱;柱温:35 ℃;流动相:0.1 mol/L磷酸二氢钾(KH2PO4);流速:1 mL/min]测定LA、AA、PA和BA含量。

1.5 数据处理

本试验数据采用Excel 2016初步处理后,采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏法进行多重比较,以P<0.05为差异显著性标准。结合本课题组王彦等[14]TOPSIS筛选发酵参数较优组合。

2 结果与分析

2.1 玉米粉添加量的优化

由表3可见,随着玉米粉添加量的增加,饲料中的CP、EE含量逐渐升高,NDF、ADF含量和pH逐渐降低,干物质损失率先升高后降低,NH3-N含量先降低后升高,添加玉米粉5%～25%组CP含量显著高于不添加玉米粉组(P<0.05),添加玉米粉5%～25%组的NDF含量和pH显著低于不添加玉米粉组(P<0.05)。通过玉米粉添加量与理想添加量的接近度可知(表4),各方案与“理想解”的相对接近度C,随着玉米粉添加量的增加而增大,即添加越多的玉米粉方案越优。综合考虑平菇菌糠开发利用的成本等因素,选择5%、10%、15%玉米粉添加量为较优水平,供正交试验进一步筛选。

表3 玉米粉添加量对菌糠发酵饲料营养成分和发酵品质的影响(干物质基础)

表4 玉米粉添加量与理想添加量的接近度

2.2 菌液接种量的优化

由表5可知,随着BS和LP复合菌液接种量的增加,饲料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物质损失率逐渐升高,pH逐渐降低,菌液接种量16%组CP含量显著高于其他各组(P<0.05),菌液接种量12%～20%组的EE含量显著高于其他各组(P<0.05)。由表6可知,各方案与“理想解”的相对接近度由大到小排在前3的菌液接种量依次是16%、12%、20%,与营养成分和发酵品质得出的结果一致。因此认为,BS和LP复合菌液接种量适宜范围是12%～20%。

表5 菌液接种量对菌糠发酵饲料营养成分和发酵品质的影响(干物质基础)

表6 菌液接种量和理想接种量的接近度

2.3 物料含水量的优化

由表7可知,随着物料含水量的增加,饲料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物质损失率逐渐升高,pH逐渐降低,物料含水量80%组的CP含量显著高于其他各组(P<0.05)。由表8可知,各方案与“理想解”的相对接近度由大到小排在前3的物料含水量依次是80%、70%、60%,与营养成分和发酵品质得出的结果一致。因此认为,物料含水量的适宜水平为80%、70%、60%。

表7 物料含水量对菌糠发酵饲料营养成分和发酵品质的影响(干物质基础)

表8 物料含水量与理想添加量的接近度

2.4 BS和LP菌种比例的优化

由表9可见,BS和LP菌种比例为3∶1组的EE含量显著高于其他各组(P<0.05),单菌BS组的NH3-N含量显著高于其他各组(P<0.05),各组的CP、NDF含量差异不显著(P>0.05)。由表10可知,各方案与“理想解”的相对接近度由大到小排在前3的BS和LP菌种比例依次是2∶1、3∶1、1∶1,因此认为,BS和LP菌种比例的较优水平为2∶1、3∶1、1∶1。

表9 BS和LP菌种比例对菌糠发酵饲料营养成分和发酵品质的影响(干物质基础)

表10 BS和LP菌种比例与理想添加量的接近度

2.5 发酵时间的优化

由表11可知,随着发酵时间的增加,饲料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物质损失率逐渐升高,pH逐渐降低,各组CP、EE含量差异不显著(P>0.05),发酵7、10和13 d组的NDF含量显著低于其他各组(P<0.05),发酵10 d组的pH与其他各组差异显著(P<0.05)。由表12可知,各方案与“理想解”的相对接近度由大到小排在前3的发酵时间依次是4、1和10 d,但发酵1、10和7 d相对接近度相差不大,综合营养成分和发酵品质,发酵时间的较优水平为7、10和13 d。

表11 发酵时间对菌糠发酵饲料营养成分和发酵品质的影响(干物质基础)

表12 发酵时间与理想添加量的接近度

2.6 发酵温度的优化

由表13可见,随着发酵温度的增加,饲料中的CP、EE含量及干物质损失率先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,pH逐渐升高。由表14可知,各方案与“理想解”的相对接近度由大到小排在前3的发酵温度依次是37、25(室温)、49 ℃,但49 ℃相对接近度较小,综合营养成分和发酵品质,发酵温度的较优水平为25(室温)、37、45 ℃。

表13 发酵温度对菌糠发酵饲料营养成分和发酵品质的影响(干物质基础)

表14 发酵温度与理想添加量的接近度

2.7 正交设计结果

由表15可知,根据改进TOPSIS中应用熵权法得到CP、EE、NDF、ADF含量,干物质损失率,pH及NH3-N、LA、AA、PA、BA含量的权重值分别为0.086、0.089、0.087、0.039、0.247、0.053、0.104、0.082、0.241、0.032、0.026。综合评分等于CP/CP最大值×0.086+EE/EE最大值×0.089+NDF/NDF最大值×0.087+ADF/ADF最大值×0.039+干物质损失率最大值×0.247+pH/pH最大值×0.053+NH3-N/NH3-N最大值×0.104+LA/LA最大值×0.082+AA/AA最大值×0.241+PA/PA最大值×0.032+BA/BA最大值×0.026。通过极差分析得出的主次序为:A>C>D>E>B>F,综合评分受A因素(玉米粉添加量)影响最大,并且在A1水平下较高,得到优化组为G1(A1B1C1D1E1F1),综合考虑单因素试验、正交试验优化结果和实际应用需要,选择A2B2C2D1E2F1进一步优化。

表15 饲料中营养成分和发酵品质正交试验结果表(干物质基础)

由于G1(A1B1C1D1E1F1)在表中,单独对A2B2C2D1E2F1做优化试验,结果见表16,A2B2C2D1E2F1相比于G1(A1B1C1D1E1F1)的CP、EE含量相差不大,NDF含量降低了13.90%,干物质损失率降低了11.82%,pH降低了16.94%,A2B2C2D1E2F1的ADF、NH3-N含量分别为22.15%、6.56%,LA、AA、PA、BA含量分别为8.23、2.87、0.16和0.09 mmol/L。A2B2C2D1E2F1相比于平菇菌糠原料,CP含量升高了34.14%(6.21%),EE含量升高了19.41%(6.08%),NDF含量降低了40.38%(52.57%),ADF含量降低了44.47%(38.89%)。综上所述,确定A2B2C2D1E2F1[即玉米添加量10%、菌液接种量16%、物料含水量80%、发酵时间7 d、BS和LP菌种比例2∶1、发酵温度25 ℃(室温)]为最优组合。

表16 最优组合筛选(干物质基础)

3 讨 论

利用微生物发酵非常规饲料不仅可以解决饲料资源浪费、污染环境等问题,还可以填补我国饲料供应的缺口,具有较大的应用前景[18-19]。混菌发酵饲料时的菌液接种量、物料含水量、菌种比例、发酵时间、发酵温度以及底物的碳源氮源等,是影响饲料中微生物生长和饲料发酵品质的代谢物积累的重要因素[20-21]。菌液接种量会改变微生物的生长、繁殖、代谢,从而影响发酵结果,菌液接种量过高,代谢产物过多会反过来抑制代谢使发酵不充分,菌液接种量过低,不能有效改善饲料品质[22]。物料含水量过高,饲料中氧气流通变少,影响微生物生长,物料含水量过低,底物溶解度太低,影响底物利用率。适宜的菌种比例可以使混菌的生长产生相互促进作用,相反某种菌比例过高,其代谢物可能产生拮抗作用,抑制其他微生物的生长。发酵时间过长,不仅会增加时间成本,还会增加底物的干物质损失率,发酵时间过短,饲料发酵品质改善不明显。温度主要影响发酵过程中的酶促效率,常用的芽孢杆菌和乳酸菌适宜温度接近,只需考虑生产中应用的需要即可。饲料中CP、EE、LA、AA含量等较高为宜,NDF、ADF含量,干物质损失率,pH及NH3-N、PA、BA含量等较低为宜,本试验以这些指标作为依据,采用单因素与正交试验相结合,并用TOPSIS模型综合评价,对发酵条件进一步筛选优化,为菌糠饲料工业化生产提供可能。

在微生物发酵饲料的发酵条件优化试验中,单因素试验是最能直观反映各因素对发酵效果的影响[23]。探究玉米粉添加量的试验中,随着玉米粉添加量的增加,发酵菌糠饲料中的CP、EE含量逐渐升高。裴朝东[24]用响应面法优化混菌发酵肉鹅青贮饲料工艺,选择酒糟、稻壳、玉米粉、象草等4个因素为自变量因子,发现各试验组发酵后EE、CP的含量均有不同程度的增加,其中EE含量的增幅为1.34%～4.33%,CP含量的增幅为3.50%～5.10%,与本试验结果一致。

玉米粉是菌糠发酵饲料中微生物初期的大量扩繁的碳源和氮源,TOPSIS综合评价得出,添加越多的玉米粉方案越优,但过多的玉米粉添加会造成菌糠资源饲料化利用的成本增加。探究菌液接种量的试验中,随着菌液接种量的增加,饲料中的CP、EE含量先升高后降低。黎光杨等[25]用解淀粉芽孢杆菌固态发酵全棉籽,发现随着接种量的增加,CP含量先升高后下降,当接种量为25%时,CP含量显著高于其余接种量,与本试验结果一致。接种量过大,导致CP、EE含量下降的原因可能是在发酵后期底物里的营养物质不足以供给大量微生物生长繁殖,微生物消耗了能改善发酵效果的代谢产物[26]。因此菌液接种量不是越大越好,TOPSIS综合评价也得出了相同的结果。探究物料含水量的试验中,随着物料含水量的增加,饲料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高。因为物料含水量直接影响菌株的生存环境和活性,进而影响产酶效果。含水量过低,菌株生长环境缺水,菌株与底物没能充分接触,生长缓慢,代谢能力低;含水量过高,底物黏稠,含氧量减少,菌株的生长繁殖受到极大影响[27]。探究菌种比例的试验中,BS、LP比例2∶1明显优于其他各组,结果与改进TOPSIS综合评价一致。在适宜的比例下,多菌株发酵能够发挥菌株间的协同作用,使发酵效果优于单菌株发酵[28]。探究发酵时间与温度的试验中,从各指标的变化趋势来看,时间、温度均有适宜的范围,温度选择室温(均温25 ℃)、37 ℃,发酵时间选择7和10 d。微生物的生长、繁殖、代谢受温度影响较大,温度适宜,菌活酶活高,所需发酵时间短,因此发酵温度和时间的优化是必要的。魏炳栋等[29]采用地衣芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、黑曲霉4株菌混合发酵玉米蛋白粉时在33 ℃发酵84 h时达到最佳效果。与本试验结果不一致的原因可能是使用的菌种不同,适宜的发酵温度也不同。

另外在正交试验中,对于不同的评价指标,发酵工艺影响因素的主次顺序不同。本研究表明,以综合评分为评价标准时,影响平菇菌糠发酵的主次因素分别是玉米粉添加量、物料含水量、发酵时间、BS和LP菌种比例、菌液接种量、发酵温度。Tao等[30]和王丹媚等[31]研究表明,影响发酵的主要因素是时间、温度、接种量;Liu等[32]研究表明,物料含水量、发酵时间、发酵温度是影响发酵的主要因素。吝常华等[33]的研究表明,影响发酵的主要因素有发酵温度、发酵时间、料水比以及菌液接种量。产生不同结果的原因可能与发酵底物、菌种、各因素水平等因素有关。本试验综合考虑单因素与正交试验优化结果和实际应用需要,选择不在正交表中的A2B2C2D1E2F1,并对其进一步优化验证,发现除CP、EE含量外,其余各指标在玉米粉添加量10%、菌液接种量16%、物料含水量80%、发酵时间7 d、BS和LP菌种比例2∶1、温度25 ℃(室温)条件下均有不同程度的改善。罗彦玉等[34]用一株蜡样芽孢杆菌来固态发酵油茶饼粕,最佳工艺条件为含水量109.9%,发酵温度31.1 ℃,接种量10.0%,发酵时间48.0 h。万里等[35]用乳酸菌和酵母菌发酵精补料,最佳发酵条件为接种量5%,接种比例2∶1、发酵温度30 ℃、水料比1∶1。沈城等[2]采用固态发酵金针菇菌糠,发现最佳的发酵参数是选择酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌做发酵剂、发酵时间7 d、发酵温度30 ℃。本试验部分条件与以上研究一致,部分有差别,可能与所测指标、所选菌种、发酵底物不一致有关。

4 结 论

本试验基于改进TOPSIS,通过单因素试验与正交试验结合探究玉米粉添加量、菌液接种量、BS和LP菌种比例、物料含水量、发酵时间、发酵温度对平菇菌糠发酵产物的营养成分和发酵品质的影响,确定了最佳发酵参数:玉米粉添加量10%、菌液接种量16%、物料含水量80%、发酵时间7 d、BS和LP菌种比例2∶1、发酵温度25 ℃(室温)。